利用164个微卫星标记分析镜鲤家系的遗传多样性和经济性状

徐浩,鲁翠云,孙效文

(1.中国水产科学院黑龙江水产研究所淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室,黑龙江哈尔滨150070;2.大连海洋大学水产与生命学院,辽宁大连116023)

利用164个微卫星标记分析镜鲤家系的遗传多样性和经济性状

徐浩1、2,鲁翠云1,孙效文1

(1.中国水产科学院黑龙江水产研究所淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室,黑龙江哈尔滨150070;2.大连海洋大学水产与生命学院,辽宁大连116023)

利用来源于细菌人工染色体文库 (Bacterial artificial chromosome,BAC)的164个微卫星标记分析了镜鲤Cyprinus carpio L.家系遗传多样性及标记与体质量、体长、体高、体厚4个性状间的相关性。结果表明:镜鲤家系68个个体在164个微卫星位点上共扩增出402条条带,观察杂合度 (Ho)为0.220 6～1.000 0,平均为0.62,多态性信息含量 (PIC)为0.243 9～0.702 8,平均为0.42,总体表现为中度多态(0.25≤PIC≤0.50),遗传多样性水平较高;利用SPSS 17.0的GLM模块分析标记与性状间的相关性,有25个标记与相应性状相关 (P＜0.05),其中6个标记与性状的相关性达到极显著水平 (P＜0.01),使用独立样本T检验和Duncan's多重比较找到了每个位点的优势基因型;利用NCBI的Blast模块将各位点序列与斑马鱼的序列进行比对,有11个位点与斑马鱼基因相关,一致度均在80%以上,其中6个基因功能已知。

镜鲤;微卫星;遗传多样性;体质量;体长;体高;体厚;相关性分析

鲤科鱼类种类多、分布广,其营养价值高,对环境适应能力极强,一直以来都是中国最流行的养殖鱼类,据 《2011年中国统计年鉴》数据显示, 2010年鲤科鱼类总产量为1 510万t,占淡水鱼类总产量 (2 225.6万t)的67.8%,养殖范围几乎覆盖全国;鲤科鱼类又是养殖鱼类育种研究工作积累最多的鱼类[1],目前已培育出了锦鲤、荷包红鲤、兴国红鲤等观赏种类,以及德国镜鲤、高寒鲤、建鲤等优良养殖品种。其中,德国镜鲤Cyprinus carpio L.由黑龙江水产研究所在20世纪80年代引入中国,经过系统选育,培育出在抗寒力、抗病力等方面优于原种德国镜鲤的选育系[2],已被全国原种和良种审定委员会认定为良种,并得到推广。不过,这些品种都是借助常规育种手段培育得到的,育种周期很长、盲目性高[3]。近年来,随着鲤养殖面积的扩大,又出现了发病率大幅上升、生长性状显著衰退等现象,虽然引起这些现象的确切原因尚不清楚,但从遗传理论和养殖经验方面推测,优良品种与普通品种杂交以及近亲繁殖所引起的种质资源严重退化,很可能是其主要原因[4]。

微卫星标记具有多态性高、共显性、在基因组中随机分布等特点,被认为是检测群体遗传多样性的最佳方法之一,Li等[5]利用30个微卫星标记分析了6个野生鲤群体的遗传多样性,结果6个群体均属中度多态。Silverstein等[6]利用9个微卫星引物对3个虹鳟群体进行遗传多样性分析,结果3个虹鳟品系均为高度多态,种质资源良好。同时,通过分析微卫星标记与目标性状的相关性,可获得与该性状基因紧密连锁的位点,进一步对优势基因型进行富集,能够很好地指导遗传育种研究。基于微卫星等分子标记的标记辅助育种,具有高效、准确、不受环境影响等特点[3],有效地弥补了采用常规手段育种的缺陷。鲁翠云等[7]利用亲本间遗传多样性数据计算遗传距离指导育种,得到了很好的育种效果。陈松林等[8]利用牙鲆抗弧菌性状标记进行育种,也得到了较好的育种效果。日本东京海洋大学Okamoto教授课题组利用QTL分析结果进行牙鲆抗淋巴囊肿病育种研究,并将抗病群体与生长快的牙鲆群体杂交,得到了几乎不染病且生长速度快的新品系,已投入到实际生产中[9]。本研究中,作者利用来源于细菌人工染色体 (Bacterial artificial chromosome,BAC)文库的164个微卫星标记,对一个镜鲤家系进行遗传多样性及经济性状分析,旨在为镜鲤种质资源检测、QTL定位以及分子辅助育种提供科学依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

以黑龙江水产研究所松浦试验站培育的德国镜鲤选育系为祖父母本,经过微卫星标记分析,选择遗传差异较大的亲本共构建35个家系[7],再次检测筛选出遗传距离较大的亲本建立单家系,从中随机选取68个个体,分别在68个水族箱 (长、宽、高分别为60、36、37 cm)内养殖,初始体质量为1.4～22.8 g,每天投喂同种饲料,投喂量以饱食为准,养殖3个月后,作为试验对象。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 参考 《分子克隆实验指南》[10]中高分子量基因组DNA的制备方法,对所取样品基因组进行提取和纯化。

1.2.2 表型性状的度量 根据中华人民共和国国家标准 《养殖鱼类种质检验》 (GB/T 18654.3-2008)中的方法进行体质量、体长、体高、体厚的测量。

1.2.3 PCR扩增及基因型分析 本研究中所用引物由中国水产科学研究院设计并提供,由上海生工生物工程技术有限服务公司合成。PCR反应体系为15 μL,其中包括Taq DNA聚合酶 (1 U)0.2 μL,1×PCR buffer(2 mmol/L MgCl2、50 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris HCl、dNTPs各200 mmol/L, 0.01%gelatin,pH 8.3)11 μL,0.01 mmol/L上、下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 0.8 μL。PCR反应程序为:94℃下预变性3 min;94℃下变性30 s,58～64℃下退火30 s,72℃下延伸30 s,共进行26个循环;72℃下再延伸5 min。PCR扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶在6 V/cm下电泳5～6 h,银染显带,拍照,使用Gel-Pro Analyzer 4.5(Media Cybernetics Inc)软件分析条带分子量。

1.2.4 数据统计与分析 对基因型数据进行分析,用 Popgene 32(http://www.ualberta.ca/～fyeh)计算等位基因频率 (P)、等位基因数 (Na)、有效等位基因数 (Ne)、观察杂合度 (Ho)、期望杂合度 (He)。多态性信息含量 (PIC)的计算公式[11]为

其中:Pi、Pj分别为群体中第i和第j个等位基因频率;n为某一基因座上的等位基因数。

使用SPSS 17.0软件对试验群体性状数据进行正态分布检验,再用GLM模块检验164个微卫星位点与体质量、体长、体高、体厚性状的相关性。对检测到的与性状显著相关的微卫星位点,做进一步的基因型差异显著性分析,如果该位点只有2个基因型,采用独立样本T检验 (Independent-samples T test)进行分析;如果有3个或3个以上基因型,则进行单因素方差分析 (One-Way ANOVA)和Duncan's多重比较。

1.2.5 Blast比对 利用NCBI的Blast模块 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 将与经济性状相关的微卫星位点序列与斑马鱼序列进行比对,找到位点所在或紧密连锁的功能基因,进一步研究其对经济性状的影响。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增及基因型

用164个微卫星标记对试验群体进行PCR扩增,经聚丙烯凝胶电泳检测,均可表现出清晰、稳定的条带,并表现出一定的多态性,共扩增出402条条带,片段长度为102～582 bp,等位基因数为2～4个不等,平均等位基因数为2.45个,部分聚丙烯凝胶电泳结果见图1。

2.2 镜鲤家系的遗传多样性

镜鲤家系在 164个微卫星位点上的 Ne为350.77,各位点介于1.374 0～3.995 5之间,平均为2.14;Ho为0.220 6～1.000 0,平均为0.62; PIC为0.243 9～0.702 8,平均为0.42,该镜鲤家系总体表现为中度多态 (0.25≤PIC≤0.50),遗传多样性水平较高 (表1)。

2.3 性状数据的正态性检验

图1 镜鲤家系在CAFS1170位点的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification of CAFS1170 in the mirror carp family

表1 镜鲤家系在164个微卫星位点上的遗传多样性(部分数据)Tab.1 Genetic diversity of mirror carp family in 164 microsatellite loci(partial data)

试验群体的体质量 (BW)、体长 (BL)、体高(BH)、体厚 (BT)4个性状均属于数量性状,采用SPSS 17.0软件的Shapiro-Wilk检验方法检测性状测量值是否符合正态分布,结果只有体高性状数据符合正态分布 (P＞0.05),根据 Q-Q图(quantile-quantile plots)结果,体质量、体长性状仅有1～2个点明显偏离,选择去除明显偏离的数据;体厚性状数据整体有一定偏离,故使用Minitab 15软件的Johnson转换,最佳拟合选定的P值为0.05,修正后的体质量 (BWX)、体长 (BLX)、体厚 (BTX)再次经Shapiro-Wilk检验,数据符合正态分布 (表2)。

表2 体质量、体长、体高、体厚正态分布检验Tab.2 Normal distribution test for body weight,body length,body height and body width

2.4 性状数据间的相关性检测

使用SPSS 17.0软件检测性状数据间的相关性,先以原始数据每两个一组绘制散点图,初步判断性状数据间存在直线相关趋势,直线相关要求变量服从正态分布,选择Pearson相关系数 (R),对修正后的数据进行检验,去除的数据按照数据缺失处理,选择按对排除缺失值。结果表明,所有性状间的R=0.144～0.901,其中除体高与体厚性状的R值 (R=0.144,P=0.242＞0.05)外,其余性状间的R值所对应的P值均小于0.01,具有极显著性统计学意义 (表3)。

表3 体质量、体长、体高、体厚之间的相关性系数Tab.3 Linear correlations among body weight,body length,body height,and body width

2.5 标记与各个性状的相关性

使用SPSS 17.0软件的GLM模块检验164个微卫星位点与体质量、体长、体高、体厚性状的相关性。结果表明,共有CAFS905等25个微卫星位点与不同性状表现出显著的相关性 (P＜0.05),其中CAFS1259、CAFS1266、CAFS1677、CAFS1678、 CAFS1757、CAFS2444共6个标记与相应的性状间表现出极显著的相关性 (P＜0.01);CAFS1285等13个位点仅与一种性状相关,CAFS1266等8个位点与两种性状相关,CAFS1677等4个位点则与3种性状相关,特别是CAFS1677位点,与体质量、体长、体高3种性状的相关性均达到了极显著水平(表4)。

表4 微卫星位点与经济性状相关性分析Tab.4 The correlation analysis between microsatellite loci and economic traits

对检测到的与性状显著相关的微卫星位点,进行基因型差异显著性检验 (α=0.05),对于只有2个基因型的位点,采用独立样本T检验;对于有3个或3个以上基因型的位点,则采用单因素方差分析检验。结果表明,各位点基因型间均表现出显著性差异。在CAFS1259等9个微卫星位点上存在3个或3个以上基因型,其中,CAFS1259的168/ 165和165/165基因型,CAFS1285的432/400基因型,CAFS1757的169/166基因型,CAFS1963的371/357基因型,CAFS1975的275/257和257/257基因型,CAFS2019的166/161基因型,CAFS2208的180/180基因型,CAFS2225的365/347、365/ 340、340/340基因型,CAFS2324的152/152基因型均值显著高于其他基因型 (P＜0.05),表现为相应性状的优势基因型;在CAFS905等16个微卫星位点上,只存在两个基因型,其中,CAFS905的152/144基因型、CAFS1003的 227/217基因型、CAFS1154的259/251基因型、CAFS1170的195/ 195基因型、CAFS1266的 267/267 基因型、CAFS1302的300/300基因型、CAFS1526的190/ 190基因型、CAFS1677的 220/220 基因型、CAFS1678的477/473基因型、CAFS1737的288/ 288基因型、CAFS1758的 309/309 基因型、CAFS2131的107/107基因型、CAFS2182的282/ 282基因型、CAFS2196的 218/218 基因型、CAFS2409的243/243基因型、CAFS2444的358/ 358基因型均值显著高于另一基因型 (P＜0.05),也表现为相应性状的优势基因型 (表5)。

表5 25个微卫星位点的不同基因型在各个经济性状中的差异显著性检验(部分数据)Tab.5 Significant difference test of economical traits in 25 microsatellite loci(partial data)

2.6 Blast比对

使用Blast模块将具有优势基因型的25个微卫星位点序列与斑马鱼序列比对,结果25个微卫星位点中共有11个位点与已知的基因相关,一致度均在80%以上,其中6个相关基因功能已知,比对结果见表6。

表6 Blast比对结果Tab.6 Blast comparison

3 讨论

鲤基因组存在基因复制现象[12],远源杂交得到的F1代个体在一个位点上常会出现3个或3个以上的等位基因[13],从而造成难以分辨的基因分离结果。本研究中所用群体,是以遗传差异较大的德国镜鲤选育系亲本作为祖父母本构建的F1代,在F1代个体中利用SSR进行基因组扫描,筛选出各位点无基因复制且遗传差异较大的个体构建F2代。利用164个微卫星标记在68个F2代个体中共检测到402个等位基因,平均Na为2.45个,平均Ne为2.14个,二者稍有偏差,说明等位基因分布略有不均,可适当增加试验鱼个体数。Ho为0.220 6～1.000 0,PIC为0.243 9～0.702 8,表现为中度多态,具有较高的遗传多样性水平,且无基因复制现象,育种效果很好,可用于进一步育种研究。

本研究中试验群体性状间的相关性为0.302～0.901(体厚与体高相关性为0.144,不具有统计学意义,因此不予考虑),相关系数值越接近1说明相关越密切。微卫星位点与性状间的相关性检验结果表明,共有25个微卫星位点与性状相关,其中12个位点同时与2个或3个性状相关,同一个微卫星位点与多个性状相关,这可能是由于基因连锁或一因多效,但也有可能是性状间具有显著的相关性所致,即该位点只与一个性状基因连锁,而性状间相关性较高,故也被检测到与其他性状显著相关,其中的作用机制尚需进一步研究探讨,这也说明人们在分子水平上的研究还不够深入。另外,各个性状均与多个微卫星位点相关,说明数量性状由多个基因控制,即一效多因。

CAFS2208位点经Blast比对,与斑马鱼znf 296基因一致性高达91%,znf 296基因具有与锌离子结合的相关功能,研究表明,锌离子与鱼类的增重具有相关性。崔立娇等[14]发现,在饲料中添加锌离子可提高星斑川鲽幼鱼的增重率。王庆奎等[15]发现,饲料中添加锌离子可提高点带石斑鱼的增重率、特定生长率、肥满度等指标。CAFS1758位点经Blast比对,与 prkcbb基因一致性高达 93%, prkcbb基因具有与雄性激素受体和金属离子结合等相关功能。研究表明,在饲料中添加一定量的雄性激素,可有效提高鲤的产量,雄性激素和雌性激素混合剂对虹鳟鱼种也有促生长作用。国内外一系列研究结果表明,铜和锌在饲料中是必不可少的微量元素,而在饲料中补充铁、锌、锰、铜,尤其是氨基酸微量元素,可使罗非鱼生长、代谢、非特异性免疫力得到显著提高[16]。CAFS2196位点与 thrab基因相关,thrab基因除具有与金属离子结合的相关功能外,还与类固醇激素、甲状腺激素受体结合等相关功能。类固醇激素已经被证实具有维持生命、调节性功能、促进机体生长发育、调节免疫力等重要作用,雄性激素也属于类固醇激素。李文笙等[17]研究发现,性类固醇激素可间接地刺激生长激素分泌并调节其基因转录水平。康现江等[18]发现,外源类固醇激素可明显加快中国对虾的生长。甲状腺激素主要对鱼类的早期发育起着重要影响[19-20],这在大黄鱼[21]、 牙鲆[22]等鱼类中已得到证实。因此,CAFS2208、CAFS1758和 CAFS2196位点可以直接应用于育种研究。另外,还有8个微卫星位点与已知基因可能存在连锁关系,但基因相关功能未知或与所讨论性状的联系尚不清楚,这些位点对生长性状的影响有待进一步验证。

不同的养殖方式、遗传背景也会对微卫星位点与性状间相关性分析结果造成很大影响,本研究中所使用的试验群体养殖于水族箱内,与池塘养殖相比,环境因素更易于控制,在饲料投喂、饱食程度上也更能得到保证,可充分体现遗传因素对生长性状的影响,但也必然造成部分分析结果与池塘养殖群体存在差异。邢新梅等[23]利用微卫星标记对池塘养殖镜鲤群体进行体型性状分析,其中有18个微卫星标记与本研究所用相同,而 CAFS1737、CAFS2131、CAFS2324这3个位点在本研究中与经济性状相关,但只有 CAFS1737位点在邢新梅等[23]的研究中体现出相关性。郑先虎等[24]对一个镜鲤家系进行体质量、体长的QTL定位研究,结果CAFS1757位点与体质量相关,与本研究结果吻合,最终被定位到38号连锁群。另外,本研究中部分位点在池塘养殖的全同胞家系190个个体中也表现出与经济性状的显著相关 (此数据尚未发表),其中CAFS2409位点与体长、体高、体厚性状相关,与本研究结果相近;CAFS1526位点与体长、体高性状相关,在本研究中该位点与体高、体厚性状相关;CAFS1758位点与体厚性状相关,而本研究中该位点与体厚性状不具有相关性。这说明CAFS1737、CAFS1757、CAFS1526、CAFS2409位点具有直接应用于育种研究的可能性,而其他位点尚需进一步验证。此外,本研究中引物来源于BAC克隆,本质上是基因组微卫星,与EST-SSR相比具有更高的多态性,更能有效地体现连锁基因的真实情况[25]。并且来源于BAC克隆的分析结果可以进一步被定位到染色体,实现与物理图谱的整合,同时,一些标记紧密连锁的基因也可能因此得到定位[26],这对基因组相关研究具有重要意义。

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Analysis of genetic diversity and economic traits in a mirror carp Cyprinus carpio L.family using microsatellite markers

XU Hao1,2,LU Cui-yun1,SUN Xiao-wen1

(1.National Local Joint Engineering Laboratory for Freshwater Fish Breeding,Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China;2.College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

In this study,164 microsatellite markers were selected from bacterial artificial chromosome BAC to analyze the genetic diversity and to mark the economic traits related to body weight,body length,body height,and body width in 64 individuals of a mirror carp Cyprinus carpio L.family.Results showed that a total of 402 alleles were found,and the value of average observed(Ho)was ranged from 0.220 6 to 1.000 0,with mean of 0.62.The value of polymorphic information content(PIC)was varied from 0.243 9 to 0.702 8,with mean of 0.42,indicating that the level of genetic diversity was moderate(0.25≤PIC≤0.50).The analysis of correlation between SSR markers and the economic traits by GLM procedure of SPSS 17.0 revealed that there were 25 SSR markers showing a significant(P＜0.05)impact on economic traits,in which 6 SSR markers showed very significant difference(P＜0.01).Superior genotypes were obtained using Duncan's multiple comparison and independent-samples T test. Through Blast analysis in NCBI,11 loci were found highly correlated(higher than 80%)with the gene of zebra fish,including 6 known function genes.

Cyprinus carpio L.;microsatellite;genetic diversity;body weight;body length;body height;body width;correlation analysis

S965.116

A

2012-09-25

公益性行业 (农业)科研专项 (200903045);国家 “863”计划项目 (2011AA100402-5);国家 “948”计划项目 (2011-G12)

徐浩 (1986-),男,硕士研究生。E-mail:xuhao861128@sina.com

孙效文 (1955-),男,研究员。E-mail:sunxw2002@163.com

2095-1388(2013)03-0247-07