水牛冷冻精液稀释液中添加复合VB对精子品质的影响

雷 虹，易康乐，燕海峰，李昊帮，孙 鏖，张佰忠，宗占伟

（湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131）

现在家畜精液冷冻技术在不断的完善和创新， 但在精子冷冻程序上并没有根本性的创新改进。 实践中，冷冻和解冻后的精子即使在质膜完整且泳动轨迹正常的情况下， 其受精能力还是明显与新鲜精液有差异。 如果要使解冻后精子的品质接近于鲜精， 就要对现有的精液保存技术和程序做进一步的改进。 通过对影响精子冷冻相关因素进行深入的研究分析， 探索冷冻损伤的原因以及温度、 渗透及氧化应激反应对精子顶体及膜的影响。 进一步分析不同动物种间及个体间精子膜的分子组成结构， 开发新型保护剂和膜保护剂应用于哺乳动物的精液冷冻保存中， 应用新技术对精子质量进行有效的评估和检测， 都将是以后精液冷冻保存技术改进的重点方向[1]。

本研究中， 利用低渗膨胀和吖啶橙诱发荧光两种检测方法，结合顶体完整性检测数据，进一步检测讨论复合VB对水牛精液冷冻的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料是由湖南省光大牧业种公牛站提供的摩拉水牛的新鲜精液作为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 精液采集与稀释

精液采集后立即进行品质评定， 畸形率低于15%才能进行后续试验。精液采精后在试管中进行平衡，后迅速用于实验。 取20μL精液样本进行稀释， 活率高于60%的精液样本才可用于冻精的制作生产。

精液稀释采用一步稀释法。 对检测密度和活率合格后的鲜精进行稀释。 处理过程中一般将精液密度保持在1.5～2.0×108/mL左右。

1.2.2 精液的降温与平衡

将处理好的样本放入盛有35℃的水浴容器中，平衡后转移到4～5℃的冰箱中降温。 降温速度控制在2～4h内从35℃降到5℃。 在降温的这段时间里， 也是渗透性抗冻剂逐步降温和平衡的过程[2～4]。

1.2.3 精液的分装和冷冻

精液充分平衡后， 在细管型精液分装机中将精液中进行分装、封口和打印。 将分装后的细管水平放置在冷冻架上。 然后放入喷氮式冷冻箱中进行冷冻处理。 本试验采用法国卡苏全自动精液冷冻仪进行降温冷冻处理。 细管从5℃降到－145℃左右。 再将冷冻好的细管从冷冻仪中取出，快速放入盛有液氮的液氮罐中保存。

1.2.4 冻精的解冻和常规检测

将冻精从液氮罐中取出， 立即放入38℃的水浴锅中解冻。 加热20s后取出细管，将细管精液转移至离心管中。 用移液枪随机吸取8～10μL精液样本滴在载玻片上，盖好盖玻片，用精子图象分析系统CEROS检测并记录精子活率[5，6]。 剩余精液样品用考马斯亮蓝R250染色、涂片，检测精子顶体完整率。同时进行低渗膨胀试验（HOST试验）检测精子质膜完整性和吖啶橙诱发荧光试验（AO-Test）检测精子染色质DNA完整性[7]。

2 试验结果与分析

2.1 复合VB 对精子活力的影响

稀释液中加入了3mL/100mL的复合VB组，复苏后0h精子活力显著高于0mL/100mL组（P<0.05）；复苏4h各组活率差异不显著（P>0.05）。复苏8h后，3mL/100mL的复合VB组复苏后0h精子活力显著高于0mL/100mL组（P<0.05）。

2.2 复合VB 对精子顶体、 质膜和DNA 完整性的影响

稀释液中加入了3mL/100mL的复合VB组的精子顶体完整性显著高于0mL/100mL组（P<0.05）， 各组的精子顶体完整率无显著差异（P>0.05）。 质膜完整性和DNA完整性各组差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

现在大多采用与黄牛相同的精液冷冻稀释液配方用于水牛的精液冷冻保存。 但在精液的理化性质方面，水牛与黄牛还是存在较大差别，水牛的精液中有较多的抑制精子活力的因子。 因此在同样的冷冻过程中， 水牛精液的冷冻效果要差于黄牛。 主要表现在水牛精子受损伤的程度较高，在低温冷冻过程精子顶体膜的损伤会导致顶体酶外渗，从而影响精子的受精能力[8～10]。

精子生物形态学分析是检测公畜生殖系统最有效的技术方法。 它能够对精子生物学功能进行评估，筛查公畜不育的原因；对人工授精、体外受精过程中使用的精子样本提供可靠的技术质量参考数据；同时在家畜遗传育种、繁殖新技术应用与推广方面提供可靠的参考数据。

在本实验室前期试验中， 证实了在水牛冷冻精液稀释液中分别添加VB12、复合VB和VC，可以起到提高精子复苏后质量的作用[11]。 而在本研究中，我们利用低渗膨胀（HOST试验）和吖啶橙诱发荧光（AO-Test）两种检测方法，在检测精子质膜完整性和精子染色质DNA完整性同时，结合顶体完整性检测数据，进一步检测讨论复合VB对水牛精液冷冻的影响。进行。进行检测。本试验结果表明，在精液冷冻稀释液种添加一定量的复合VB能够提高水牛精液冷冻复苏后的活力和顶体完整性。

[1]易康乐. 水牛冷冻精液稀释液配方改进的研究[D]. 广西大学：南宁，2005.

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[7]李晟, 易康乐, 燕海峰, 等. 猪精液冷冻保护剂研究进展[J]. 家畜生态学报. 2012, 33(5):112～116.

[8]王丕建主编．王丕建论文集[M]．南宁：广西科学技术出版社，1996.

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[11]易康乐, 刘锐鑫, 黄卫红, 等. 几种维生素对水牛精液冷冻的试验[J].中国畜禽种业，2009,(8):55～57.