小分子封闭提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性

王 芬，陈飞飞，高为芳，杜方川，王安明，谢 恬

（1.杭州师范大学材料与化学化工学院，杭州311121；2.杭州师范大学生物医药与健康研究中心，杭州311121；3.杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州311121）

小分子封闭提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性

王 芬1，2，陈飞飞1，2，高为芳2，杜方川1，3，王安明1，谢 恬2

（1.杭州师范大学材料与化学化工学院，杭州311121；2.杭州师范大学生物医药与健康研究中心，杭州311121；3.杭州师范大学生命与环境科学学院，杭州311121）

为了提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性，在制备共价固定化嗜热菌蛋白酶的基础上，通过选择氨基酸和醇类小分子来封闭载体表面未反应的活化基团，并考察了固定化酶的催化活性及热稳定性。结果发现：L⁃Trp和L⁃Val封闭修饰固定化酶时，在80℃的水浴中加热150 min后其剩余活力仍为93.4%和98.6%，其效果约为未经小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶的2倍。所筛选的几种小分子物质中，叔戊醇、L⁃Trp、L⁃Val及L⁃Ala不仅能提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性，而且也可以提高固定化酶的相对活力，从而更有利于其在工业生产中的应用。

封闭；末端基团；固定化；热稳定性；嗜热菌蛋白酶

天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且在反应中易混入产品从而影响产品纯度，使其难以在工业中有更为广泛的应用。此外，酶的分离和提纯以及一次性使用也大大增加了酶作为催化剂的成本。而固定化酶能够改善酶的性质，使酶具有更好的稳定性和更高的使用效率，并且能够回收利用，极大地节约了生产成本。但是固定化是将酶束缚或限制于一定区域内，这对酶的结构和活性带来一定的影响。另外，周围环境对酶也会产生一定的影响，不及体内可以给酶提供一个最适的环境。

2007年，Jiang等［1］曾报道大分子可以提高酶的内在催化活力，并且可以提高酶在溶液中的稳定性。这是因为利用大分子可以模拟出类似于活性细胞中那种拥挤的微环境，也就是酶在体内生存的微环境。但是很少有关于为固定化酶模拟一个细胞内的微环境来提高酶在体外的一些性能的报道。因此近几年来，越来越多的学者开始关注如何构建一个微环境以便有利于固定化酶各项性能。Wang等［2］将大分子共价连接在MCFs载体上，模拟一个细胞内的大分子拥挤环境，不但使青霉素酰基转移酶的催化活力提高了1.8倍，而且最适反应温度从45℃提高到了55℃。载体与酶的多点固定化方法也已经有了诸多的报道［3-5］，其中，多点固定化使酶与载体可以更好的连接，明显地提高固定化酶的负载率、催化活力和稳定性。但是酶与载体之间的共价键越多，固定化酶并非就越稳定，因为载体表面上多余的活性基团也有可能与酶产生一些不良反应，从而增加酶失活的可能性。

笔者采用小分子封闭的方法将载体表面上多余的活性基团去除，以提高酶的稳定性，以期进一步提升和扩大该固定化酶的使用性能及范围。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

1.1.1 试剂

嗜热菌蛋白酶（50～100 U／mg）、α-甲基苄胺、聚（乙二醇）-block-聚（丙二醇）-block-聚（乙二醇）（P123），美国Sigma公司；脂肪酸甲酯磺酸盐（MES）、脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；氟化铵、对苯醌、1，3，5-三甲苯（TMB）、正硅酸四乙酯（TEOS），国药集团化学试剂有限公司；甲苯，衢州巨化试剂有限公司；硅烷偶联剂JH-A112，郑州市江汉精细化工有限公司；盐酸乙二胺，阿拉丁公司；二乙胺，上海化学试剂采购供应五联化工厂。

1.1.2 仪器

恒温振荡器（水浴）（国华企业公司），蛋白分析仪（DU730）（Beckman Coulter公司）。

1.2 载体（MCFs⁃NH2）的制备

1.2.1 水热过程

先称取P123 5.34 g用水分批次溶解使其能全部转移到容器中去，再加入61.34 mg氟化铵后开始搅拌，最后加入6.2 mL TMB和27.4 mL盐酸（质量分数36.5%）。设置搅拌转速为250 r／min、40℃下搅拌45 min，然后加入12.6 mL TEOS，继续搅拌20 h。搅拌完毕之后，将溶液转入高压反应釜中，置于烘箱中120℃老化24 h。最后用水过滤，烘干待用。

1.2.2 去模板反应

称取上面所制的载体1.0 g于高压反应釜中，加入10 mL浓HNO3（质量分数65.5%）和7 mL双氧水（质量分数30%），置于烘箱中100℃反应12 h。然后用水洗涤过滤，烘干待用。

1.2.3 硅烷化

称取4.5 g步骤1.2.2中制得的去模板载体于三口烧瓶当中，接着加入甲苯270 mL，氨基化试剂27 mL（硅烷偶联剂JH-A112），再通冷凝水，油浴110℃加热回流12 h，待反应结束后冷却然后分别用甲苯和无水乙醇洗涤，待载体中的有机溶剂基本挥发之后，放入烘箱中烘干得MCFs⁃NH2，孔径为26 nm。

1.3 载体的活化

称取10 mg制备好的MCFs⁃NH2于反应瓶中，用3 mL 1.5 mmol／L的对苯醌溶液溶解，在25℃下，160 r／min的摇床中活化2 h。活化结束后，分别用20%（体积分数）乙醇和去离子水洗涤2次，放于4℃冰箱中备用。

1.4 嗜热菌蛋白酶的固定化

整个反应体系为3 mL。将10 mg活化好的氨基化的MCFs载体重新分散于2.6 mL包含3 mol／L NaCl，20 mmol／L ZnCl2的pH 7.0、0.02 mol／L MES⁃NaOH的缓冲溶液中。将此载体液按每克MCFs⁃NH2中40 mg嗜热菌蛋白酶（以自由酶计）的加酶量，加入1 mg／mL的嗜热菌蛋白酶液0.4 mL，得到混合液。混合液再在0～7℃、40 W微波条件下照射3 min。

1.5 酶活的测定方法

先将1.5 mL 1.33%（100 mL溶液含1.33 g干酪素）的干酪素溶液和含10 mmol／L CaCl2、0.1 mol／L NaCl的40 mmol／L pH为7.5的Tris⁃HCl缓冲液0.3 mL置于圆底烧瓶中，37℃水浴中预热2 min，然后加入0.2 mL孵育过的酶液，在恒温振荡器（水浴）中37℃、160 r／min振荡反应10min，往反应液中加2 mL终止液，继续反应20 min。最后反应液用滤膜过滤，滤液在275 nm下测紫外吸收。空白对照是0.2 mL酶液（包含10 mmol／L CaCl2，0.1 mol／L NaCl的40 mmol／L pH为7.5的Tris⁃HCl缓冲液），其他操作同上。

1.6 热稳定性实验

热稳定性以固定化酶剩余活力表示，剩余活力以热处理后固定化酶活力与热处理前的初始活力之比。

固定化酶的相对活力表示为

1）小分子封闭 将固定好的嗜热菌蛋白酶分别移到小烧瓶中，往小烧瓶中分别加入100μL配制好的小分子溶液，使得它们的终浓度为3 mmol／L，然后将以上的混合液在恒温培养摇床中25℃、160 r／min反应4 h。

2）固定化酶重新分散 反应结束后，小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶用固定化时所用的缓冲液洗涤3遍，洗涤液用考马斯亮蓝法（Bradford法）检测其未固定上的蛋白含量。固定化酶用A液重新分散，稀释132倍。

3）固定化酶孵育 将稀释了132倍的酶液在80℃水浴中孵育不同时间后取出一定溶液进行酶活测定。

2 结果与讨论

2.1 酶失活和小分子封闭

为了提高酶的稳定性，进一步提升和扩大固定化酶的使用性能及范围，笔者采用小分子封闭的方法将载体表面上多余的活性基团去除，其酶失活和小分子封闭的过程及机制如图1所示。

图1 酶失活和小分子封闭的过程及机制Fig.1 Possiblemechanisms of enzyme deactivation and quenching excessive activated groups of imm obilized carriers

2.2 胺类封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性的影响

选择盐酸乙二胺、二乙胺和α-甲基苄胺作为胺类中的小分子对固定化嗜热菌蛋白酶进行封闭，孵育条件为80℃水浴。其中，盐酸乙二胺、二乙胺和α-甲基苄胺固定化酶的相对活力分别为72.6%、114.1%和118.4%。

图2为胺类对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定的影响。由图2可知：在前60 min内，与无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶活力相比，盐酸乙二胺和α-甲基苄胺封闭的固定化嗜热菌蛋白酶活力下降的幅度减小；而二乙胺封闭的固定化嗜热菌蛋白酶活力下降的幅度较大。但在延长孵育时间后，有小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶活力下降的幅度反而增大。在80℃水浴中孵育150 min后，发现小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶几乎都失去了催化活力。综上可知，这3种胺类小分子物质都不太适合用于固定化嗜热菌蛋白酶。

图2 胺类封闭对固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性的影响Fig.2 Effects of am ine on thermal stability of immobilized thermolysin

2.3 二元醇封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性的影响

选择不同的二元醇（乙二醇、戊二醇、己二醇）作为小分子物质对固定化嗜热菌蛋白酶进行封闭，孵育条件为80℃水浴，考察其对固定化嗜热菌蛋白酶催化活性及热稳定性的影响，结果见图3。乙二醇、戊二醇和己二醇作为小分子对固定化嗜热菌蛋白酶进行封闭4 h后，固定化嗜热菌蛋白酶的活力均下降，分别使嗜热菌蛋白酶的活力下降了27.8%、74.3%和47.9%。

图3 二元醇封闭对固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性的影响Fig.3 Effects of diol on thermal stability of immobilized thermolysin

由图3可知：在80℃水浴中孵育30 min后，乙二醇封闭的固定化嗜热菌蛋白酶活力下降了20.9%；当孵育150 min后，其剩余活力仅20%。戊二醇使固定化嗜热菌蛋白酶的活力下降趋势更快，孵育120 min后，蛋白酶几乎丧失活力。而己二醇，在孵育的前60 min内，蛋白酶的活力保持不变，但是孵育90 min之后活力迅速降低；在孵育150 min时，固定化嗜热菌蛋白酶催化活力仅保留了27.6%。

综上所述，二元醇对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性有不利的影响。

2.4 一元醇封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性

的影响

选择甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇和叔戊醇作为一元醇小分子对固定化嗜热菌蛋白酶进行封闭，考察其对固定化酶活力的影响，不同的一元醇所对应的相对活力分别为57.0%、60.3%、27.2%、42.1%和100%。可见，几种一元醇中，只有叔戊醇辅助的固定化酶的催化活力仍能保持游离酶的水平。

在此基础上考察它们的热稳定性，结果见表1。由表1可知：叔戊醇封闭提高了固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性：在80℃水浴中孵育30 min后，叔戊醇封闭的固定化嗜热菌蛋白酶的催化活力仅下降了2.8%，而无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶的催化活力却下降了17%。孵育150 min后，叔戊醇封闭的固定化嗜热菌蛋白酶剩余催化活力仍为53.5%。并且与无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶相比，叔戊醇封闭的固定化嗜热菌蛋白酶剩余活力整体下降趋势更加缓慢。然而其他几个一元醇小分子物质封闭的固定化嗜热菌蛋白酶在80℃水浴中孵育30 min后活力丧失。由此可知，这几个小分子物质中，仅叔戊醇封闭对提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性有效。

表1 一元醇封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性的影响Table 1 Effects of alcohol on thermal stability of immobilized thermolysin

2.5 芳香族氨基酸封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性影响

芳香族氨基酸封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性影响结果见图4。由图4可知：以L⁃Trp为小分子对固定化嗜热菌蛋白酶进行封闭时，效果显著。在80℃水浴孵育，2 h之内L⁃Trp封闭的固定化嗜热菌蛋白酶的活力毫无下降，甚至孵育150 min后，其剩余活力仍为93.4%，由此可见，L⁃Trp封闭的固定化嗜热菌蛋白酶的耐热性能有非常显著的提高。且L⁃Trp封闭还提高了酶初始活力，L⁃Trp封闭后固定化嗜热菌蛋白酶的相对活力为114.9%。

选择的另一个芳香族氨基酸是苯丙氨基酸（L⁃Phe）。发现L⁃Phe封闭固定化嗜热菌蛋白酶的相对活力为100%，其热稳定性，相比于无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶来说，在80℃水浴中孵育60 min之前下降较小。但是延长孵育时间后，苯丙氨基酸封闭的固定化嗜热菌蛋白酶活力下降得更快，当孵育150 min后，其剩余活力为41.7%。因此相比较而言，L⁃Trp对固定化嗜热菌蛋白酶的活力和热稳定性都有明显提高，是嗜热菌蛋白酶固定化过程中合适的小分子物质。

图4 芳香族氨基酸封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性的影响Fig.4 Effects of aromatic am ino acid on thermal stability of immobilized thermolysin

2.6 脂肪族氨基酸封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性的影响

分别用L⁃Ala、L⁃Gly、L⁃Ile、L⁃Leu和L⁃Val封闭后固定化嗜热菌蛋白酶，结果发现它们所对应的相对活力分别为108.3%、98.8%、119.5%、106.4%和118.2%，这表明这些氨基酸都能保护载体表面的酶蛋白的结构，能增强它们的催化活性。同时，部分脂肪族氨基酸（L⁃Ala、L⁃Gly、L⁃Ile、L⁃Leu和L⁃Val）封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性有显著提高，结果见图5。

由图5可知：L⁃Val封闭的固定化嗜热菌蛋白酶有良好的热稳定性。在80℃水浴中孵育，2 h内其催化活力基本没有下降的迹象；在150 min后剩余活力仍为98.6%，约为无小分子封闭固定化嗜热菌蛋白酶的2.0倍。而对于L⁃Ala封闭的固定化嗜热菌蛋白酶，在80℃下孵育时，其催化活力下降幅度不大，当孵育了150 min后，其剩余活力仍为90%，是无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶催化活力的1.8倍。

图5 脂肪族氨基酸封闭对固定化嗜热菌蛋白酶热稳定性的影响Fig.5 Effects of aliphatic am ino acid on thermal stability of immobilized thermolysin

与无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶相比，L⁃Gly封闭的固定化嗜热菌蛋白酶在孵育过程中，蛋白酶的催化活力下降的速度较慢。L⁃Ile封闭的固定化嗜热菌蛋白酶在孵育的前30 min，活力下降得快；但在30～120 min内，其活力下降的速度却比无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶要缓慢。至于L⁃Leu，前30 min内对固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性基本没有影响。

通过氨基酸小分子封闭的结果比较可以看出，固定化酶的热稳定性不仅是和载体表面的多余的活性基团有关，而且与载体表面的化学性能及微环境有关。小分子封闭过程中，小分子一方面封闭了未反应基团，另一方面不同的小分子修饰后改变了载体表面的物化性能和微环境，从而使得固定化酶表现出不同的热稳定性和催化性能。在前期的工作中发现，氨基酸类小分子适合于固定化青霉素酰化酶的未反应基团封闭，而醇类分子适合固定化脂肪酶的未反应基团的封闭［2］。

综上可知，L⁃Val与L⁃Ala是两个效果较好的小分子，可以提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性，使其可以应用于比较苛刻的反应条件下。

3 结 论

1）叔戊醇可以提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性。在80℃水浴的孵育过程中，叔戊醇封闭的固定化嗜热菌蛋白酶活力下降的速度比无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶的要慢。因此，叔戊醇是嗜热菌蛋白酶催化合成阿斯巴甜前体反应常用的有机溶剂，这将为阿斯巴甜的合成提供良好的理论基础。

2）芳香族氨基酸中L⁃Trp是比较合适的小分子物质，可以很大程度提高固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性。发现在80℃的水浴中孵育时，2 h之内L⁃Trp封闭的固定化嗜热菌蛋白酶的活力毫无下降，甚至孵育150 min后其剩余活力仍为93.4%。

3）脂肪族氨基酸中L⁃Val和L⁃Ala都可以使固定化嗜热菌蛋白酶的热稳定性得到很大的提高，特别是L⁃Val封闭的固定化嗜热菌蛋白酶。当在80℃水浴中孵育时，2 h内其催化活力基本没有下降的迹象，150 min后剩余活力仍为98.6%，是无小分子封闭的固定化嗜热菌蛋白酶剩余催化活力的2倍；而L⁃Ala封闭的固定化嗜热菌蛋白酶在80℃的高温下孵育150 min后，其催化活力仍保留90%。

4）固定化酶的热稳定性不仅是和载体表面的多余的活性基团有关，而且与载体表面的化学性能及微环境有关。

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Enhancement of thermal stability of immobilized thermolysin using end⁃group blocking

WANG Fen1，2，CHEN Feifei1，2，GAOWeifang2，DU Fangchuan1，3，WANG Anming1，XIE Tian2

（1.College of Material，Chemistry and Chemical Engineering，Hangzhou Normal University，Hangzhou 311121，China；2.Research Center for Biomedicine and Health，Hangzhou Normal University，Hangzhou 311121，China；3.College of Biological and Environmental Sciences，Hangzhou Normal University，Hangzhou 311121，China）

In order to enhance the thermal stability of the immobilized thermolysin，unreacted active end groups on the carrier surface were blocked with reagents such as amino acids and alcohols，after the thermolysin was covalently immobilized on the carrier.Both catalytic activity and thermal stability of the immobilized enzyme were investigated.The results showed thatafter heated at80℃in water for150 min，the residual activities of the immobilized enzymes blocked and modified by L⁃Trp and L⁃Val were about 93.4%and 98.6%，respectively，which was approximately 2 times higher than that of the immobilized thermolysin.Among the blocking reagents，tert⁃amyl alcohol，L⁃Trp，L⁃Val and L⁃Ala not only improved the thermal stability of immobilized thermolysin，but also enhanced the relative activity of the immobilized enzyme，thus itwasmore useful for its industrial application.

blocking；end group；immobilization；thermal stability；thermolysin

Q814.2

A

1672-3678（2013）06-0047-06

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.010

2012-08-31

国家自然科学基金（20906016，21076053）；教育部长江学者和创新团队发展计划（IRT1231）；浙江省自然科学基金（Y13B060058）；杭州市农业科研攻关专项（20120232B13）

王 芬（1986—），女，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：天然药物的化学酶法制备；王安明（联系人），副研究员，E⁃mail：waming＠hznu.edu.cn