高山被孢霉淬灭方法及胞内代谢产物的气相色谱质谱分析比较

刘 欣，傅宁华，张红漫，纪晓俊，张 鑫，杨健健，黄 和

（1.南京工业大学生物与制药工程学院材料化学工程国家重点实验室，南京210009；2.南京工业大学理学院，南京210009）

刘 欣1，傅宁华1，张红漫2，纪晓俊1，张 鑫2，杨健健1，黄 和1

（1.南京工业大学生物与制药工程学院材料化学工程国家重点实验室，南京210009；2.南京工业大学理学院，南京210009）

在花生四烯酸生产菌高山被孢霉代谢组学研究中，需利用胞内代谢物的提取手段并基于气相色谱-质谱（GC⁃MS）分析方法对其进行检测。比较了3种胞内代谢物提取方法及不同色谱柱条件下GC⁃MS分析结果。研究表明：采用冷甲醇淬灭分别较液氮直接淬灭及真空过滤后，减少了胞内代谢物的泄露并更好地实现了胞外及胞内代谢物的分离。在对代谢物分析的比较中，极性色谱柱（DB⁃FFAP）检出的代谢物仅为11种，主要为有机酸、醛类；而代谢物经衍生化后采用非极性色谱柱（DB-5）共检出32种化合物，主要为糖、糖苷及醇类。

花生四烯酸；高山被孢霉；代谢组学；代谢产物；取样；GC⁃MS分析

花生四烯酸（arachidonic acid，ARA），即全顺式5，8，11，14-二十碳四烯酸，是属于ω-6系列的必需长链多不饱和脂肪酸（PUFAs），对促进大脑功能和提高视网膜发育是不可或缺的物质［1］。此外，ARA还具有降低血脂、增强免疫力、抗癌等功效，被广泛应用于功能保健、生物医药、化妆品及饲料添加剂等方面［2］。

高山被孢霉（Mortierella alpina）是生产ARA的重要工业菌株，利用代谢组学技术可以深入了解微生物代谢产物之间的相互关系［3］，对以高山被孢霉为代表的工业微生物进行研究有利于进一步认识和改造它们。微生物代谢组学研究中，试样的采集和代谢物分析是获取代谢物组数据并进行生物学解析的前提，对它们的方法进行研究是十分必要的。

试样采集过程为保持细胞收集时刻的生理状态不发生改变，需要对细胞进行快速取样及淬灭。液氮淬灭技术作为一种标准方法常用于丝状真菌及其他生物中［4］。此方法的优点是淬灭代谢反应迅速，且淬灭剂无极性、无残留。但直接对发酵液进行淬灭后，得到的试样包含了胞内及胞外的所有代谢物。因此，淬灭前的分离是改进此方法的重要环节。由于丝状真菌的培养基具有高黏度、非均一且不易收集的特点［5］，通常采用真空过滤的方式分离［6］。此外，冷甲醇溶液（-45℃）也被广泛用于细菌［7］、酵母［8］及丝状真菌［5，9］的代谢反应淬灭中，此方法具有较温和的特点。笔者拟考察基于3种不同淬灭方法的取样技术对于胞内代谢物泄露的影响，为后续的实验奠定基础。

气相色谱-质谱（GC⁃MS）系统在代谢物的分离与鉴定中起着关键作用。除仪器型号不同外，其主要的区别归于色谱柱型号。对于非极性色谱柱DB-5而言，对试样进行分析前需要进行柱前衍生化。而对于极性柱DB-FFAP而言，试样无需衍生化就可以直接进样。同时基于Deans switch的GC⁃MS直接进样的方法，在DB-FFAP极性柱上可以实现对代谢物水溶液进行直接分析的过程。笔者主要比较非极性DB-5及极性DB-FFAP 2种色谱柱对代谢物的分析能力，以获得最适合用于M．alpina胞内代谢物的分析方法。

1 材料与方法

1.1 菌种

经紫外诱变后获得的高山被孢霉ME-1（Mortierella alpina ME-1）菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面上于4℃条件下保藏，每3个月进行转接。

1.2 培养基与培养条件

取已培养好的新鲜斜面菌种，用无菌水洗下菌丝，接种于种子培养基中（g／L）：葡萄糖30，酵母膏5.0，KH2PO43.0。转速120 r／min，25℃培养48～72 h。待种子生长至对数生长期转接5 mL种子液至50 mL发酵培养基中（g／L）：葡萄糖80，酵母膏6.0，KH2PO44.0，NaNO33.0，MgSO4·7H2O 1.0，pH 6.0～8.0。培养条件为转速120 r／min，温度23℃，发酵7 d，于对数生长后期取样（约96 h）。

1.3 淬灭方法

1.3.1 液氮直接淬灭

5 mL发酵液直接投入装有50 mL液氮的研磨钵中迅速淬灭。淬灭后于-50℃、2 kPa真空度条件下冻干除去发酵液中的水分（FreeZone Plus 2.5 L、低压冻系统，美国Labconco公司），干菌体用于胞内代谢产物提取。

1.3.2 真空过滤后于液氮中淬灭并研磨

5 mL发酵液通过直径60 mm的滤纸（孔径5 μm）于真空抽滤装置中迅速过滤除去发酵液，同时采用去离子水清洗菌丝细胞。过滤后的菌体直接迅速地投入装有25 mL液氮的研磨钵中迅速淬灭，并伴随快速持续的机械研磨，直至被研成粉末，菌粉用于胞内代谢产物提取。

1.3.3 甲醇淬灭

5 mL发酵液直接投入-40℃的25 mL甲醇溶液中（体积分数60%，含10 mmol／L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），pH＝7.0）。混合物于6 000 r／min、-10℃条件下离心3 min，菌体沉淀物用于胞内代谢物提取。

1.4 提取方法

细胞淬灭后得到的上述干菌体、菌体沉淀及菌粉于1 mL含60 mmol／L HEPES缓冲液的乙醇溶液中（体积分数75%，80℃）提取3 min后于10 000 r／min，-10℃条件下离线2 min，收集上清液用于代谢产物的检测。

1.5 GC⁃MS检测方法

1.5.1 基于DB-FFAP色谱柱的分析方法

气质色谱仪，5975C MSD／7890A GC（Agilent公司）。进样体积1μL，分流比，10∶1，石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm，DB-FFAP，Agilent公司）；进样口温度，250℃。升温程序为初始温度70℃，以5℃／min升温至140℃，以8℃／min升温至180℃，保持10 min，最后以5℃／min升温至230℃，并保持6 min。质谱条件为传输线温度，250℃；离子源温度，230℃；电子轰击模式，EI 70 eV。四级杆质量分析器温度，150℃；采集质量数范围为30～500 amu。He为载气，采用横流模式，流速1.5 mL／min载气。溶剂延迟，3 min。基于Deans Switch系统，在特定时间将部分色谱柱流出试样进入TCD检测器而不通过MS。Deans Switch切割起始时间4.10 min，结束时间7.00 min。TCD检测器温度，220℃。

1.5.2 基于DB-5色谱柱的柱前衍生化及分析方法

100μL提取物于N2浓缩仪中干燥。干燥后的试样加入50μL甲氧基铵盐酸盐（20 mg／mL的吡啶溶液），于40℃条件下反应80 min，其后加入80μL N-甲基-N-（三甲基硅氧烷）三氟乙酰胺（MSTFA），40℃条件下反应80 min。

衍生化后的试样用于GC⁃MS分析检测。进样体积1μL，不分流进样。石英毛细管色谱柱（30 m× 0.25 mm×0.25μm，DB-5MS，Agilent公司）；进样口温度，250℃。升温程序为初始温度70℃，保持2 min，以5℃／min升至300℃，保持3 min。质谱条件为传输线与离子源温度280℃，电子轰击模式，IE 70 eV。采集质量数范围为50～600 m／z。He为载气，采用横流模式，流速1 mL／min［10］。

2 结果与讨论

2.1 淬灭方法对代谢产物泄漏的影响

由于NADPH、NADH、丙酮酸（pyruvate）、葡萄糖-6-磷酸（G6P）、NADP、NAD以及ATP的快速降解速率，因此它们常作为不稳定的代谢物代表被用于考察采样技术对代谢产物的泄漏情况［5，11］。代谢物的胞外含量占总量的百分比定义为代谢物的胞外相对含量。其中采用液氮对发酵液直接进行淬灭可以得到胞内及胞外代谢产物的总量，通过检测发酵液上清中代谢物含量，计算得到代谢物的胞外相对含量，反映了淬灭前原始的胞外代谢产物信息，并将其作为对照；采用真空过滤后于液氮中淬灭的方法是通过检测滤液中代谢物含量与其和胞内代谢物之和的比值得到代谢物的相对含量；而采用甲醇淬灭的方法则通过淬火后混合物上清中代谢物的含量与其和胞内代谢物之和的比值得到代谢物的相对含量。本文中笔者通过后2种淬灭方法计算得到代谢物的胞外相对含量与对照的差异，从而比较它们对胞内代谢物泄露的影响。考察不同淬灭方法对M．alpina胞内代谢产物泄漏的影响，结果见图1。

图1 淬灭方法对M．alpina胞内代谢产物泄漏的影响Fig.1 Effects of different quenchingmethods on the leakage of intracellular metabolites in M．alpina

由图1可知：采用甲醇淬灭及过滤后液氮淬灭2种采样技术时，NAD和NADP几乎不会从细胞中泄漏出来。与对照相比，过滤后于液氮中淬灭的方法导致NADPH、G6P和NADH的胞外相对泄漏量分别为44.7%、21.3%和16.2%，差异十分显著。这可能由于真空过滤时细胞内外的巨大压力差对细胞产生胁迫从而导致代谢产物的大量泄漏。虽然这一方法从整体的淬火过程处理来看与MS相比耗时短、过程简单，但从代谢产物的完整性和稳定性上来看并不是最好的。而采用甲醇淬灭时胞外代谢物的相对含量与对照相比相差范围在-5.8%～21.9%。由此，采用甲醇淬灭的方法所产生的泄漏相对较小，可以作为M．alpina于天然培养基条件下进行代谢反应淬灭的最佳方法。

2.2 基于DB⁃FFAP质谱柱的代谢产物检测

表1为M．alpina胞内代谢产物经极性质谱柱DB⁃FFAP分离后检测出的代谢产物结果。由表1可知：经分析检测出的代谢产物总数为11个，其中包括有机酸、酮类、醛类及醇类等极性化合物。

2.3 基于DB-5质谱柱的代谢产物检测

表2为M．alpina胞内代谢产物经非极性柱DB-5分离后的检测结果。由表2可知，总检出代谢物个数为32，主要为糖类、糖苷类及醇类代谢产物。

表1 基于DB⁃FFAP色谱的3组平行实验中重现的代谢产物Table 1 Reproduciblemetabolites of three sets of parallel experiments based on DB⁃FFAP column

表2 DB-5分离得到的代谢产物检出情况Table 2 Detection ofmetabolites isolated by DB⁃5 column

表2 （续表）

表3为极性色谱柱及非极性色谱柱对代谢产物的分析比较结果。由表3可知：极性色谱柱DB FFAP在无衍生化条件下有利于酮类、醛类等极性的代谢产物的分析；而基于非极性柱（DB 5）的分析代谢产物经衍生化后具有更好的稳定性和挥发性适合于糖类、糖苷类、醇类等带有羟基的化合物的气相色谱的检测，因此在实际试样分析中对于以全部代谢物为目标的分析需同时采用2种柱子，对于特定目标的代谢产物应采用不同特性的色谱柱进行分析。

表3 代谢产物总检出情况Table 3 Total amount of detected metabolites

3 结 论

在对M．alpina胞内代谢物采集方法中，甲醇淬灭方法产生的代谢物泄露比真空过滤后再于液氮中淬灭的结果要低。对于极性的代谢产物可以无需衍生化采用极性的质谱柱直接实现分离；而对于难挥发的糖类、糖苷类等化合物的检测较适合经衍生化后通过非极性质谱柱分离。对于同一生物试样采用不同极性的色谱柱可以实现不同种类化合物的定性检测。因此根据目标需求可以采用单一色谱柱或两种色谱柱进行分析。

［1］ 袁成凌，姚建铭，余增亮.花生四烯酸及其代谢物的生物学作用［J］.中国药物化学杂志，2000，10（1）：75⁃78.

［2］ Gill I，Valivety R.Polyunsaturated fatty acids：1.occurrence，biological activities and applications［J］.Trends Biotechnol，1997，15（10）：401⁃409.

［3］ Fridman E，Pichersky E.Metabolomics，genomics，proteomics，and the identification of enzymes and their substrates and products［J］.Curr Opin Plant Biol，2005，8（3）：242⁃248.

［4］ Gummer JP A，Krill C，Du Fall L，et al.Metabolomics protocols for filamentous fungi［C］∥Bolton M D D，Thomma，B P H JP. Plant fungal pathogens：methods and protocols.New York： Humana Press，2012：237⁃254.

［5］ Hajjaj H，Blanc P J，Goma G，et al.Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra⁃and extracellularmetabolites in filamentous fungi［J］.FEMS Microbiol Lett，1998，164（1）：195⁃200.

［6］ Smart K F，Aggio R B M，van Houtte J R，et al.Analytical platform formetabolome analysis ofmicrobial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography⁃mass spectrometry［J］.Nat Protoc，2010，5（10）：1709⁃1729.

［7］ Wittmann C，Krömer JO，Kiefer P，etal.Impact of the cold shock phenomenon on quantification of intracellular metabolites in bacteria［J］.Anal Biochem，2004，327（1）：135⁃139.

［8］ Gonzalez B，Francois J，Renaud M.A rapid and reliable method formetabolite extraction in yeast using boiling buffered ethanol［J］.Yeast，1997，13（14）：1347⁃1355.

［9］ Ruijter G JG，Visser J.Determination of intermediarymetabolites in Aspergillus niger［J］.J Microbiol Methods 1996，25（3）：295⁃302.

［10］ Ding M Z，Wang X，Yang Y，et al.Comparative metabolic profiling of parental and inhibitors⁃tolerant yeasts during lignocellulosic ethanol fermentation［J］.Metabolomics，2011，8（2）：232⁃243.

［11］ Link H，Anselment B，Weuster⁃Botz D.Leakage of adenylates during cold methanol／glycerol quenching of Escherichia coli［J］. Metabolomics，2008，4（3）：240⁃247.

Com parison of sam pling method of intracellular metabolites in Mortierella alpina and the analysis of themetabolites by GC⁃MS

LIU Xin1，FU Ninghua1，ZHANG Hongman2，JIXiaojun1，ZHANG Xin2，YANG Jianjian1，HUANG He1

（1.State Key Laboratory of Materials⁃Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009；2.College of Sciences，Nanjing University of Technology，Nanjing 10009）

In the metabolomics study on arachidonic acid production by Mortierella alpina，sampling method of intracellular metabolites and their detection based on GC⁃MS analysis are needed.The comparisons of three samplingmethods and GC⁃MS analysis results in two chromatographic columnswere carried out.The results showed that cold methanol quenching caused lessmetabolites leakage and more effective separation of extra⁃and intracellular metabolites than direct quenching in liquid nitrogen and vacuum filtration followed by quenching in liquid nitrogen.In the comparison of analysis ofmetabolites，only 11 metabolites were determined by polar column（DB⁃FFAP），including organic acids and aldehydes.However，32 metabolites were determined by non polar column（DB⁃5），including sugars，glycosides，and alcohols.

arachidonic acid；Mortierella alpina；metabolomics；metabolites；sampling；GC⁃MS analysis

S182

A

1672-3678（2013）06-0063-05

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.013

2012-09-29

国家自然科学基金（21176124）；国家自然科学基金重点项目（20936002）；国家科技支撑计划（2011BAD23B03）；江苏省高校优势学科建设工程

刘 欣（1983—），女，吉林长春人，博士研究生，研究方向：微生物发酵与代谢工程；黄 和（联系人）：教授，E⁃mail：biotech＠njut. edu.cn