硫胺素对Arthrobacter sp.A302环磷酸腺苷发酵的影响

要世伟，牛欢青，陈 勇，应汉杰

（南京工业大学生物与制药工程学院材料化学工程国家重点实验室，南京210009）

硫胺素对Arthrobacter sp.A302环磷酸腺苷发酵的影响

要世伟，牛欢青，陈 勇，应汉杰

（南京工业大学生物与制药工程学院材料化学工程国家重点实验室，南京210009）

研究在培养基中加入硫胺素（VB1）对cAMP发酵的影响。结果表明：VB1的最适添加量为0.5 g／L，与对照组相比，环磷酸腺苷（cAMP）产量和细胞干质量分别提高了36.4%和41.8%，达到7.5和7.8 g／L。琥珀酸和α-酮戊二酸的含量有明显的提高，平均提高了43.59%和40.77%；同时，主要副产物乙酸的含量没有明显变化。在发酵过程中，VB1的加入对ATP的含量及与cAMP合成密切相关的几种酶的活性也有显著的影响。

硫胺素（VB1）；cAMP；Arthrobacter

环磷酸腺苷（cAMP）作为细胞的第二信使，在生物的代谢过程、基因表达、细胞分裂和细胞迁移等许多生物过程中起到非常重要的作用［1-2］。cAMP具有多种药理学功能，例如增强肝脏功能，舒张血管，放宽平滑肌和促进神经再生［3］。微生物法生产cAMP比化学合成法更简单，成本更加低廉，因此具有广阔的发展前景［4］。

目前，利用生物法合成cAMP仍有许多问题，其根本问题是产量不高。在Arthrobacter sp.A302中，对cAMP合成途径（图1）的研究发现，cAMP是由AMP转化为ATP，然后再环化得到的［5］。在由AMP合成ATP的过程中需要大量的能量供给，而己糖磷酸途径（EMP）和三羧酸循环途径（TCA）是生物体能量的主要来源。因此，EMP途径和TCA循环途径在该过程中具有重要作用，加强EMP途径和TCA循环对提高cAMP的产量具有很重要的意义。另外，AMP是由IMP合成得到，而IMP的合成底物为PRPP。在Arthrobacter sp.A302中，通过补救途径来合成cAMP是一条非常重要的代谢途径［5］。因此，PRPP在cAMP的合成过程中是一个关键的中间代谢产物，提高PRPP在代谢过程中的积累是提高cAMP产量的一种有效手段。在HMP途径中，6-磷酸葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脱氢酶的作用下，催化生成核糖-5-磷酸，进而合成PRPP。因此，通过增强微生物的EMP途径和TCA循环途径以及提高6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）的活性能有效提高生物体能量的供给以及促进PRPP的合成，进而提高cAMP的产量。

VB1作为生物体内参与能量代谢的多种酶的辅因子［6］，能够有效提高碳代谢途径中酶的活性，在生物体的碳代谢循环中起到了至关重要的作用。因此，笔者从cAMP合成的代谢途径出发，研究VB1的添加对Arthrobacter sp.A302菌体的生长及cAMP产量的影响，通过检测胞内ATP的水平，测定菌体在发酵过程中的几种有机酸含量的变化以及几种关键酶的活性改变，来初步探究VB1促进cAMP产量提高的原因。

图1 Arthrobacter A302cAMP合成图Fig.1 Schematic illustration of the biosynthesis of cAMP by Arthrobacter A302

1 材料和方法

1.1 菌种

Arthrobacter sp.A302，南京工业大学国家生化中心应汉杰教授课题组筛选保藏。

1.2 培养基

斜面培养基（g／L）：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏10，NaCl 3，琼脂20。pH 7.2。

种子培养基（g／L）：葡萄糖10，蛋白胨10，酵母膏10，牛肉膏10，NaCl 3。pH 7.2。

发酵培养基（g／L）：葡萄糖40，K2HPO418，KH2PO45，MgSO40.1，尿素10，生物素0.003，CoCl20.005，NaCl 0.4，次黄嘌呤8。pH 7.0。

以上培养基都在121℃灭菌15 min后备用。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

将-80℃冰箱保存菌种接种于斜面培养基活化，30℃培养48 h。斜面培养基上的菌苔接种于种子培养基，30℃、280 r／min摇床培养24 h；将培养好的种子培养基以10%的接种量接入发酵培养基，30℃、280 r／min摇床培养72 h。以上种子培养基及发酵培养基均用500 mL摇瓶，装液量为30 mL。

1.3.2 分析测定

cAMP采用液相检测（HPLC，Agilent公司1200系统），C18柱（Lichrospher，4.6 mm×300 mm，5 μm），进样量20μL。流动相为甲醇及磷酸三乙胺缓冲液（0.05 mmol／L），二者体积比为20∶80，流速为0.8 mL／min，25℃，254 nm波长检测。葡萄糖含量用SBA生物传感仪（山东省科学院生物研究所）检测。细胞含量采用紫外分光光度计（Beckman公司）于660 nm条件下检测浊度。蛋白质检测用考马斯亮蓝法。有机酸检测为高效液相色谱法（Agilent1200 series），流动相为3.0mLH2SO4，流速为0.4 mL／min，60℃，210 nm波长检测。ATP浓度采用Glomax发光检测仪（Promega公司）测定。酶活采用分光光度法测定［7］。

2 结果与讨论

2.1 VB1对发酵过程中cAMP及生物量的影响

图2为不同VB1对cAMP和生物量的影响结果。由图2可知：在低浓度的条件下，cAMP的产量随着VB1浓度的提高而增加；当VB1的质量浓度高于0.5 g／L，cAMP产量开始下降；当VB1的质量浓度为0.5g／L时，cAMP的产量达到最大值（7.5 g／L）。

图2 VB1添加量对cAM P产量的影响Fig.2 Effects of VB1concentrations on cAMP production

发酵前期是菌体快速增长的时期，发酵产物cAMP的产量与菌体的生长情况密切相关，因此，检测发酵过程中的菌体的生长情况能间接反映出产物的产量高低。

考察添加0.5 g／L VB1对Arthrobacter sp.A302发酵性能的影响，结果见图3。由图3可知：发酵24 h后，菌体生长进入稳定期，cAMP大量积累。与对照组相比，发酵72 h结束后，细胞干质量提高了41.8%，由5.5 g／L提高到7.8 g／L；cAMP产量从5.5 g／L提高到7.5 g／L，提高了36.4%。实验结果表明，在培养基中添加VB1对细胞的生长具有显著作用，与Chung等［8］研究的结果一致。一方面，VB1作为丙酮酸脱氢酶复合体的辅酶［9-10］，在丙酮酸的代谢过程中起到至关重要的作用，提高VB1的浓度能有效提高丙酮酸脱氢酶复合体的活性，进而加强细胞对丙酮酸的利用，促进细胞的生长。另一方面，作为一种转酮醇酶的辅因子［9］，VB1也可能对磷酸戊糖途径产生影响，磷酸戊糖途径为微生物的生长提供了大量的NADPH，NADPH含量的降低会抑制微生物细胞壁的合成［10］，因此，磷酸戊糖途径代谢强度的大小与微生物的生长息息相关。从以上几方面可以看出，VB1与细胞的生长具有密切联系。

2.2 VB1对发酵过程中ATP含量的影响

对Arthrobacter sp.A302的cAMP代谢过程（图1）的分析可知，cAMP是由ATP直接环化得到的产物，细胞内ATP水平的高低对cAMP的合成产生直接影响，其含量越高越有利于cAMP的合成。同时，在补救途径中，PRPP是合成cAMP的关键中间产物，ATP为PRPP的合成提供了能量。

图3 添加0.5 g／L VB1对发酵的影响Fig.3 Effects of adding 0.5 g／L VB1on fermentation

考察添加VB1对发酵过程中ATP的影响，结果见图4。由图4可知：添加VB1能明显提高细胞内ATP的水平。在发酵到12 h左右，ATP的含量达到了最高水平。在添加VB1的条件下，细胞中ATP的最高水平提高了35.50%。丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶都是VB1依赖酶［11-12］，丙酮酸脱氢酶能催化丙酮酸生成乙酰辅酶A，进而参与到TCA循环途径中；α-酮戊二酸脱氢酶更是TCA循环中的限速酶，催化α-酮戊二酸生成琥珀酰辅酶A。因此，在微生物利用丙酮酸代谢生成ATP的过程中，VB1起到很关键的作用。此外，有文献报道，在动物及人的TCA循环途径中，酶的活性会随着VB1的含量下降而降低［13］，这导致TCA循环的强度减弱，降低了细胞内ATP的合成。

图4 VB1对ATP的影响Fig.4 Effects of VB1on ATP concentration

2.3 VB1对发酵过程中有机酸含量的影响

TCA循环为生物的生长提供了主要的能量，对生物的生长起到关键作用。在TCA循环中产生的多种有机酸可作为代谢中间产物参与到机体代谢的许多方面。因此，对TCA循环中产生的有机酸的测定也能反映出生物代谢活动的强度。表1为发酵过程中琥珀酸、α-酮戊二酸和乙酸的质量浓度变化结果。由表1可知：在发酵24 h时琥珀酸和α-酮戊二酸的质量浓度达到最大值，添加VB1后，琥珀酸和α-酮戊二酸的质量浓度平均提高了43.59%和40.77%。在培养基中添加VB1能提高α-酮戊二酸脱氢酶的活性，进而促进TCA循环，增加琥珀酸和α-酮戊二酸的积累。另外，在cAMP的合成途径中，乙酸是由丙酮酸转化为乙醛再氧化得到一种重要的副产物。从表1还可以看出，与对照相比，VB1对乙酸的合成没有明显影响，即在cAMP的合成过程中没有过多的副产物累积。乙酸代谢途径是合成丙酮酸的主要竞争途径［14］，乙酸含量越高说明进入TCA循环途径的丙酮酸量越少。因此，乙酸含量的高低直接关系到Arthrobacter sp.A302在合成cAMP的过程中对丙酮酸的有效利用。

表1 VB1对有机酸的影响Table 1 Effects of VB1on organic acid production

2.4 VB1对代谢过程中关键酶活的影响

磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PYK）和6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）这3种酶在cAMP的合成过程（图1）中起到关键性的作用。因此考察添加VB1对cAMP代谢过程中关键酶活的影响，结果见图5。

由图5可知：在发酵过程中，PFK的活性呈现出先下降再上升再下降的趋势；相比于对照组，添加VB1后使PFK活性提高的时间提前，酶活平均提高了32.92%。不添加VB1的条件下，PYK的活性在初期会下降；添加VB1后，PYK的酶活平均提高了20.23%。相比于对照组，添加VB1对G6PDH的活性有明显的提升效果，其活性平均提高了49.62%。VB1作为多种酶的辅酶，在生物的碳代谢过程中发挥重要的作用。作为PFK和PYK的辅酶，在培养基中添加VB1能有效提高这2种酶的活性，Xu等［15］在研究乳酸发酵的过程中也发现了VB1对PFK等酶活力的促进作用；另外，作为一种转酮醇酶的辅因子，VB1同时也能提高G6PDH的活性［9］。

3 结 论

VB1对Arthrobacter sp.A302合成cAMP的产量具有显著影响，添加的最佳质量浓度为0.5 g／L；摇瓶发酵cAMP的最高产量达到7.5 g／L，同时，细胞干质量也有明显增加，最高可达7.8 g／L；添加VB1能有效加强EMP途径及TCA循环，为细胞的生长代谢及cAMP的合成提供更多的能量；与对照相比，细胞中PFK、PYK及G6PDH 3种酶的活性得到明显提高。

图5 VB1对PFK、PYK和G6PDH比酶活的影响Fig.5 Effects of VB1on PFK，PYK，and G6PDH enzyme activities

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Effects of thiam in on production of cyclic adenosinemonophosphate by Arthrobacter sp.A302

YAO Shiwei，NIU Huanqing，CHEN Yong，YING Hanjie

（State Key Laboratory of Materials⁃Oriented Chemical Engineering，College of Life Science and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China）

The effects of addition of thiamine（VB1）on cyclic adenosine monophosphate（cAMP）production by Arthrobacter sp.A302 were investigated.The results showed that the addition of 0.5 g／L VB1was optimum for cAMP production and cell growth.The cAMP yield and the biomass reached 7.5 g／L and 7.8 g／L，and they were improved by 36.4%and 41.8%，respectively，compared with the control.The concentrations of succinic acid andα⁃ketoglutarate increased by 43.59%and 40.77%，and the production of acetic acid had no obvious change by addition 0.5 g／L VB1.The addition of VB1also affected the content of intracellular ATP and activities of several enzymes closely related to biosynthesis of cAMP.

Thiamine（VB1）；cAMP；Arthrobacter

Q814

A

1672-3678（2013）06-0019-05

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.004

2012-11-15

国家杰出青年基金（21025625）；国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA021203）；国家重点基础研究发展计划（973计划）（2011CBA00806）；国家自然科学基金青年基金（21106070）；教育部长江学者和创新发展计划（PCSIRT）；江苏省自然科学基金（SBK201150207）；江苏省高校优势学科建设工程项目（PAPD）

要世伟（1987—），男，河北邢台人，硕士研究生，研究方向：生物工程、发酵工程；陈 勇（联系人），助理研究员，E⁃mail：chenyong1982＠njut.edu.cn