敲除ace E基因对大肠杆菌生长和丙酮酸代谢的影响

宋灿辉，张伟国

（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122）

敲除ace E基因对大肠杆菌生长和丙酮酸代谢的影响

宋灿辉，张伟国

（江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122）

大肠杆菌ace E基因是编码丙酮酸脱氢酶多酶复合体PdhR的关键酶之一。利用Red重组系统敲除大肠杆菌MG1655的ace E基因后，阻断了丙酮酸流向TCA循环，导致丙酮酸的累积，也使菌体生长受到影响，在培养基中补加5 g／L KAc后可以在一定程度上弥补菌株在生长上的缺陷。摇瓶发酵36 h，MG1655没有积累丙酮酸，MG1655Δace E∷cat菌株可以积累26.77 g／L丙酮酸，为利用大肠杆菌发酵生产丙酮酸奠定了基础。

ace E；大肠杆菌；丙酮酸；Red重组

丙酮酸是一种重要的有机中间体，在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途［1］。丙酮酸是机体代谢的中间产物，处于糖酵解途径的末端，同时又连接着己糖磷酸途径（EMP）和三羟酸循环（TCA），处于代谢途径中的关键代谢支点，在细胞中很容易代谢为其他产物，难以积累，只有切断或弱化丙酮酸的进一步代谢，才能达到使其在细胞中积累并分泌到胞外的目的［2］。丙酮酸脱氢酶（PDH）多酶复合体包含了3种酶：丙酮酸脱氢酶（E1p）、二氢硫辛酰转乙酰基酶（E2p）和二氢硫辛酸脱氢酶（E3）。其中，ace E、ace F和lpd A分别编码这3种蛋白［3］。当敲除ace E后，PDH失去将丙酮酸转化为乙酰CoA的能力，中心代谢途径因为没有足量的乙酰CoA供应而出现障碍，但是在培养基中添加一定量的乙酸盐，菌体可以利用乙酸盐合成乙酰CoA，从而可以弥补生长上的不足［4］，并开始积累丙酮酸。

目前，用于丙酮酸生产的菌株有酵母、放线菌和细菌［2］。工业化生产所用菌株主要是酵母，其中以球拟酵母的研究和应用最多，发酵所用酵母都为维生素等多种营养缺陷性，培养基配制比较复杂，且发酵温度较低，一般在30℃左右，发酵周期为60 h［5-6］。大肠杆菌最适培养温度为37℃，具有发酵温度高和繁殖速度快等优点。利用大肠杆菌产丙酮酸的策略是阻断丙酮酸进入TCA循环，如敲除lpd A基因可以积累一定量的丙酮酸［7-8］。本文中笔者主要考察敲除大肠杆菌MG1655的ace E基因对菌体生长和产丙酮酸的影响，以期获得高产丙酮酸的大肠杆菌菌株，为选育产丙酮酸的工业化生产菌株奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株和质粒

大肠杆菌MG1655（E．coli str.K-12 substr. ATCC 47076）、质粒pKD46和pKD3由笔者所在实验室保藏。

1.2 试剂

L-阿拉伯糖、氨苄青霉素（Amp）、氯霉素（Cm）、琼脂糖、Tris、SDS、胶回收试剂盒和基因组提取试剂盒，上海生工；Primix Ex Taq、Dpn I、DL 15 000和DL 10 000，TaKaRa（大连）公司；蛋白胨、酵母膏，Difico公司；葡糖糖为食品级，NaCl、（NH4）2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·5H2O、NaOH、KAc、KCl、MgCl2和CaCl2均为市售国产分析纯试剂。

1.3 培养基和培养条件

LB培养基（1 000 mL）：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g；pH 7.0。

SOB培养基（1 000 mL）：蛋白胨20 g，酵母膏5 g，NaCl 0.5 g，1 mol／L KCl 2.5 mL；pH 7.0。灭菌后，加入1 mol／LMgCl220 mL。

SOC培养基（1 000 mL）：蛋白胨20 g，酵母膏5 g，NaCl 0.5 g，1 mol／L KCl 2.5 mL；pH 7.0。灭菌后，加入1 mol／LMgCl210 mL，1 mol／L葡萄糖20 mL。

摇瓶种子培养基（1 000 mL）：葡萄糖25 g，（NH4）2SO415 g，KH2PO41 g，酵母膏2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MnSO4·5H2O 0.01 g，KAc 5 g，CaCO340 g。用NaOH调pH 7.0，121℃灭菌20min。

摇瓶发酵培养基（1 000 mL）：葡萄糖40 g，（NH4）2SO416 g，KH2PO41 g，酵母膏2 g，MgSO4·7H2O 1 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，MnSO4·5H2O 0.01g，KAc 5 g，CaCO340 g。用NaOH调pH 7.0，121℃灭菌20min。

摇瓶发酵：装液量为25 mL（500 mL摇瓶）；用接种环取两环MG1655Δace E∷cat在种子培养基中培养12 h，按8%的接种量转接于发酵培养基中，培养36 h后，葡萄糖消耗完，发酵结束。

大肠杆菌培养条件37℃、100 r／min；氨苄青霉素使用终质量浓度100μg／mL、氯霉素使用终质量浓度25μg／mL；需要添加KAc时，加入量为5 g／L；相应固体培养基中添加20 g／L的琼脂。

1.4 丙酮酸测定方法

取适当发酵液，稀释100倍后，10 000 r／min离心5 min，上清经0.22μm滤膜过滤，采用HPLC测定其中丙酮酸含量。DIONEXP680型色谱仪（美国戴安公司）：色谱柱Kromasil100-5 C18250mm×4.6mm；流动相水（含0.02 mol／L KH2PO4）和乙腈，两者体积比为90∶10；流速0.6 mL／min；进样量10μL；紫外检测器；检测波长210 nm；柱温25℃。

1.5 ace E的敲除

将pKD46（Amr）化转MG1655，涂布氨苄平板，在30℃培养12 h后，挑取单菌转接液体LB，于30℃培养12 h。取1 mL培养的菌液转接于100 mL新鲜液体LB中（Amp 100μg／mL，L-阿拉伯糖10mmol／L），于30℃培养。当菌液OD600为0.2时，将L-阿拉伯糖浓度调为30 mmol／L，继续培养至OD600为0.6，将菌液冰浴20 min，4 000 r／min、4℃离心10 min收集菌体，用预冷的10%甘油洗涤4次后，将菌体浓缩为1 mL感受态细胞，50μL分装，于-20℃保存。

打靶片段M ace E的获得：用引物M ace E⁃F、M ace E⁃R以pKD3为模板，PCR扩增出打靶片段M ace E，用Dpn I隔夜消化模板后，胶回收，最后用灭菌双蒸水洗脱。

电转化体系：50μL感受态细胞和10μLM ace E轻柔混匀后，加入电击杯，冰浴10 min。

电转化条件：1 mm电击杯，1 800 V，5 ms，25 μF，200Ω。

电转化后，立即加入1 mL预热至37℃的SOC（含有5 g／L KAc），37℃复苏2 h，离心收集菌体后，浓缩为200μL，涂布于2个SOB平板（25μg／mL Cm，20 mmol／L MgCl2，5 g／L KAc）。于37℃培养16 h后，挑取阳性转化子于SOB平板并用鉴定引物ace E⁃F和ace E⁃R进行菌落PCR，鉴定M ace E是否重组到ace E中。将菌落PCR鉴定正确的单菌，切胶回收Δace E片段，进行测序。

表1 Red重组所用的引物Table 1 O ligonucleotides used for Red recombination

表2 扩增M ace E的反应体系和条件Table 2 PCR protocol and program for am p lification of M ace E

表3 扩增ace E和Δace E∷cat的反应体系和条件Table 3 PCR protocol and program for am plification of ace E andΔace E∷cat

pKD46的去除：将测序正确的菌落接于LB（Cm 25μg／mL，KAc 5 g／L）中，于42℃培养12 h后，在氯霉素抗性平板上划线培养，将长出的单菌分别点在氯霉素抗性和氨苄抗性的平板。挑取在氯霉素抗性平板长，在氨苄抗性板上不长的菌即为去除pKD46的MG1655Δace E∷cat。

2 结果与讨论

2.1 ace E基因的敲除

利用Red重组系统，成功将ace E基因敲除并鉴定，结果如图1所示。由图1可知：用鉴定引物扩增MG1655基因组，能扩增出2 800 pb条带；扩增MG1655Δace E∷cat能扩增出1 226 bp条带。将扩增出的1 226 bp条带进行胶回收，送往上海生工进行测序，测序结果显示Cm抗性基因cat成功替换掉了ace E基因。

图1 利用pKD3敲除ace E的PCR鉴定Fig.1 PCR verification of ace E knockout in MG1655

2.2 KAc对MG1655和MG1655Δace E∷cat生长的影响

在LB培养基中分别添加0、5、10、15和20 g／L KAc，取MG1655和MG1655Δace E∷cat的隔夜培养物500μL转接于50 mL LB，培养12 h，每隔2 h测定600 nm处的吸光值，绘制生长曲线见图2和图3。

图2 KAc添加量对MG1655的影响Fig.2 Effects of different KAc concentration on MG1655 grow th

由图2可以看出：添加KAc使MG1655的对数期延迟，随着添加量的增大，进入对数期越晚；添加5 g／L的KAc和不添加KAc的对数期一致，说明5 g／L KAc的添加量对菌体生长几乎没有抑制作用；添加5、10、15和20 g／L KAc后，菌体的生物量分别比未添加KAc增加了15.1%、20.9%，23.4%和18.9%，说明菌体利用乙酸盐作为C源，有助于生物量的增加。

图3 KAc添加量对MG1655Δace E∷cat生长的影响Fig.3 Effects of different KAc concentrations on MG1655Δace E∷cat grow th

由图3可知：ace E的缺失，造成丙酮酸不能进入TCA循环，使中心代谢途径出现严重障碍，生长缓慢。在添加5 g／L KAc后，在4 h后才进入对数期，与图2结果相比，比MG1655的对数期延迟了约2 h；未添加KAc，菌体在8 h后也出现增长，可能是菌体利用接种的500μL过夜培养物中的少量KAc的缘故。

2.3 MG1655Δace E∷cat的摇瓶发酵结果

经过36 h的摇瓶发酵，葡萄糖耗尽，取发酵液测定丙酮酸的含量。图4为MG1655和MG1655Δace E∷cat发酵液中的丙酮酸HPLC分析结果。由图4可知：MG1655发酵液中未检测到丙酮酸，而MG1655Δace E∷cat发酵液中含有丙酮酸。经测定，MG1655Δace E∷cat发酵液中丙酮酸含量为26.77 g／L。

3 结 论

ace E基因的敲除对大肠杆菌生长有严重的负面影响，需在培养基中添加5 g／L的KAc以维持生长；MG1655和MG1655Δace E∷cat在40 g／L葡萄糖的发酵培养基中培养36 h后，MG1655不产丙酮酸，MG1655Δace E∷cat产丙酮酸为26.77 g／L，对葡萄糖转化率为0.67 g／g。

在后期的研究中，可以对发酵培养基的葡萄糖、玉米浆、（NH4）2SO4和CaCO3的浓度及接种量进行进一步的优化，以实现丙酮酸的进一步积累。

图4 标准品及MG1655和MG1655Δace E∷cat发酵液HPLC分析图谱Fig.4 HPLC standard m ixture and fermentation sam ples of MG1655 and MG1655Δace E∷cat

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Effects of ace E gene knockout on grow ing and pyruvate biosynthesis of E．coli

SONG Canhui，ZHANGWeiguo

（Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Gene ace E encodingwas one of the key enzymes of pyruvate dehydrogenase complex regulator. Using Red recombination，the gene ace E of E．coli MG1655 was knockouted to block the pyruvate flow TCA cycle，causing pyruvate accumulation and growth deficiency.The medium supplemented with 5 g／L KOAc could make up the growth defect to a certain extent strains.MG1655Δace E∷cat in shake flask fermentation for 36 h could produce pyruvate with 26.77 g／L，initial strain MG1655 did not produce pyruvate.

ace E；E．coli；pyruvate；Red recombination

Q814

A

1672-3678（2013）06-0015-04

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.003

2012-08-12

国家高技术研究发展计划（863计划）（2008AA02Z212）

宋灿辉（1986—），男，河南洛阳人，硕士研究生，研究方向：基因工程；张伟国（联系人），教授，E⁃mail：zhangwg168＠126.com