卡介苗各亚株间Rv1985c和Rv1986基因缺失的研究

张 雯 张媛媛 陈 晨*

（中国疾病预防控制中心传染病预防控制所生物信息室，北京 102206）

卡介苗各亚株间Rv1985c和Rv1986基因缺失的研究

张 雯 张媛媛 陈 晨*

（中国疾病预防控制中心传染病预防控制所生物信息室，北京 102206）

目的明确卡介苗群体内在Rv1985c和Rv1986两个位点上的遗传差异。方法基于结核分枝杆菌设计引物，针对21株卡介苗标准株和临床株进行Rv1985c和Rv1986两个位点的PCR鉴定，鉴定基因的缺失情况。结果21株卡介苗中10株缺失Rv1985c基因，11株缺失Rv1986基因。结论卡介苗中部分菌株中两个基因位点的缺失，为今后的疫苗改造提供了备选位点，同时本研究中所建立的PCR方法也可以在临床上用于部分卡介苗菌株与结核分枝杆菌的快速鉴别。

结核；卡介苗；缺失；Rv1985c；Rv1986

结核病（tuberculosis，TB）危害人类健康已有数千年之久，曾被称为人类的白色瘟疫[1]。卡介苗（Bacille Calmette Guérin，BCG），是目前世界上唯一获准用于预防结核病的疫苗，于1921年由法国科学家卡尔梅特（Calmette）和介朗（Guérin）研制成功。卡介苗是通过将牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）在甘油胆汁马铃薯培养基上历经13年（1908～1921年）长期培养传代，最终得到的减毒菌株。这种减毒菌株，丧失了对人类的致病能力，但仍保持有较高的免疫原性，成为了可预防结核病的卡介苗疫苗[2]。在中国，卡介苗已被列为国家计划免疫疫苗之一，婴儿出生后立即接种，因此又被称为“出生第一针”。在英国、印度、巴西等其他国家卡介苗也都广泛推行。目前，卡介苗总免疫覆盖率近乎覆盖了世界人口的80%[3]，每年约有一亿儿童接种卡介苗，是人类历史上使用最多的疫苗。自1921年研发成功后，卡介苗被许多国家相继引入并应用于临床，在不同的实验条件下传代，最终产生分布于世界各个地域的BCG亚株，如BCG-Pasteur、BCG-Tokyo等[4]。众多的BCG亚株在形态、生化特征和免疫效应差异等方面都具有显著差异[5]。例如，BCG-Glaxo和BCG-Danish在英国的免疫保护作用高达60%～80%[6，7]。在美国南部的卡介苗亚株的免疫效率仅有14%[8]。明确卡介苗各株间的遗传差异，了解卡介苗的遗传背景，筛选针对特定人群的最优疫苗，是疫苗使用和改造的基础。

近三十年来，卡介苗的各种缺陷逐渐显现[9]。大量临床统计结果表明，卡介苗平均预防保护率仅在50%左右[6]，其有效性需要进一步提高。另一方面，目前卡介苗的适用人群有限。卡介苗仅能有效保护儿童预防结核病（＞80%），对青少年和成人的效果则很弱[3]。卡介苗各亚株针对不同人群也具有显著的效应差异[10]。如BCG-Glaxo和BCG-Danish在英国的免疫保护作用高达60%～80%，但越接近赤道，效果愈差[6，7]。在美国南部的卡介苗亚株的免疫效率仅有14%[8]。由于目前世界上唯一可应用的抗结核病疫苗卡介苗在有效性和普适性方面缺陷明显，因此对卡介苗进行改造，开发新的高效安全的结核病疫苗，是目前结核病预防控制工作的重要内容和保障人民健康安全的迫切需求，而对卡介苗的遗传背景的了解，特别是针对与免疫原性密切相关的抗原表位遗传背景的研究，是疫苗改造的前提和基础。

本研究中针对Rv1985c和Rv1986这两个涵盖多个抗原表位的基因，在卡介苗群体内进行多态性调查，发现了其在多个卡介苗亚株中的缺失现象，再次从分子生物学角度上证实了卡介苗各株间的遗传差异，为不同卡介苗间的效应差异提供了解释，为今后新型抗结核疫苗研制提供了线索。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

来源于国际标准菌种库的13株卡介苗标准株和收集于中国各地的8株卡介苗临床株，以及1株结核分枝杆菌标准株H37Rv。

1.2 PCR方法

采用CTAB法从菌株中分别提取核酸做为PCR反应模板。基于NCBI数据库上得到Rv1985c和Rv1986核苷酸序列分别设计引物 （Rv1985cF：5’ GAAATGCGCTACCTACCAGTG 3’；Rv1985cR：5’GTGAACCCGTCGGATAGATG 3’；Rv1986F：5’ACCGTCGTGTTGCTAGGC 3’；Rv1986R：5’ATACCGCACTGGCTGTGAC3’）。 94℃预变性5min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min，1%琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物长度。

2 结 果

本文基于常规PCR方法检测出Rv1985c和Rv1986两个基因在卡介苗群体里的遗传多态性。结核分枝杆菌H37Rv所拥有的这两个基因，在21株卡介苗标准株和临床株中并非普遍存在。21株卡介苗中仅有11株含有Rv1985c基因，10株含有Rv1986基因（图1）。8株BCG临床菌株中，西安BCG也被发现缺失这两个基因。该结果再次证实了，卡介苗各亚株间存在显著的遗传差异。由于Rv1985c和Rv1986含有了结核分枝杆菌中抗原表位60540、1150、24522和25123。

图1 PCR结果

M1 2 3 4 5 678 MarkerBirkhaug China Danish Frappier Glaxo Japan MoreauPasture Rv1985c - + - - - - - -Rv1986 - + - - - - - -Marker Phipps Pragure Russia Sweden Tice FJ07113FJ06111FJ06050 Rv1985c - - + + + + + + Rv1986 - - + + - + + + MarkerJL06395HN04129HN04200GX06088西安BCGH37RvddH2O Marker Rv1985c + + + + - + Rv1986 + + + + - +

3 讨 论

本研究说选用的菌株具有一定的代表性，不仅采用13株来自于世界各国的标准株，同时也采用了8株来自于中国不同地区的BCG临床株，实验结果证实了不同卡介苗标准株之间确实存在遗传差异，即使是同属中国临床株的8株BCG菌株间也存在差别。

卡介苗不同亚株间遗传差异的鉴定，特别是部分菌株内含有重要抗原表位的2个基因（Rv1985c和Rv1986）的缺失，可以从分子生物学水平上解释不同BCG效应差异的问题。卡介苗中抗原表位的丢失和遗传突变的产生，通过影响基因的表达水平和改变蛋白的空间结构，引起卡介苗各亚株的免疫效率差异[10]。抗原表位（Epitopes）是蛋白抗原分子表面能够决定抗原特异性的数个氨基酸残基组成的特殊序列及空间结构，是蛋白抗原上引起机体免疫应答的关键部位，在抗原发挥免疫学功能时起到决定作用。据国际免疫表位数据库（IEDB）统计，目前已被鉴定的结核分枝杆菌中的抗原表位已有3641个。相较于结核分枝杆菌，卡介苗在培养分化过程中发生了大量的抗原表位的丢失和单核苷酸点突变[11]，这些发生遗传变异的抗原表位与卡介苗的免疫效率相关，有望成为研制新型疫苗的靶分子，被用于抗结核新型重组疫苗和表位疫苗的开发。如ESAT-6中含有多个T淋巴细胞表位和B细胞表位[12]，是结核菌短期培养滤液蛋白中一种特异的蛋白抗原，仅存在于致病性结核杆菌中，在卡介苗菌株中丢失，不表达ESAT-6蛋白[13]。Pym等的研究结果表明，拥有ESAT-6中部分抗原表位的重组疫苗（BCG：RD1-2F9）在动物模型中表现出比BCG更强的免疫保护力。因此，明确卡介苗中所丢失的抗原表位和抗原表位上的多态性位点是新型疫苗构建工作开展的首要任务，基于抗原表位的重组疫苗和表位疫苗的构建也是目前新兴抗结核疫苗研制的热点之一。卡介苗群体内部分菌株2个基因（Rv1985c和Rv1986）的缺失，为今后进一步改造卡介苗，提供了可供改造的位点，同时也可以作为鉴别不同亚株的靶标位点，有效运用于临床，对致病的结核分枝杆菌和部分卡介苗亚株进行鉴别。

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Deletion of Two Genes of Rv1985c and Rv1986 in Several BCG Strains

ZHANG Wen, ZHANG Yuan-yuan, CHEN Chen

(Institute of Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, P. O. Box 5, Beijing 102206, China)

ObjectiveTo clear BCG group on genetic differences in the inner Rv1985c and Rv1986 two of sites.MethodIdentified by PCR primers were designed based on Mycobacterium tuberculosis, BCG for 21 standard strains and clinical isolates Rv1985c and Rv1986 two of sites identified gene deletion.Result21 BCG 10 missing Rv1985c gene, 11 missing Rv1986 gene.ConclusionSome strains of BCG in the two loci lack of alternative sites for future vaccine transformation, PCR method established in this study can be used in the clinical part of the BCG strain of Mycobacterium tuberculosisrapid identification.

Tuberculosis; BCG; Deletion; Rv1985c; Rv1986

R52

B

1671-8194（2013）15-0001-02

国家自然科学基金青年基金（课题编号81201322）和艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治重大专项（课题编号2013ZX10003006-002）资助

*通讯作者：E-mail： chenchen@icdc.cn