野生茄托鲁巴姆叶片提取物抑制黄瓜枯萎病菌的提取条件优化

李云鹏，赵启慧，郭鹏康，卢 潇，虎学山，娜木日嘎

（黑龙江大学 农业资源与环境学院，哈尔滨 150080）

0 引 言

野生茄托鲁巴姆（Solanum torvum）为茄科茄属植物，其根系发达，吸收水分、养分能力强，植株生长势极强，且抗性强，能同时抗4种土传病害：茄子黄萎病、枯萎病、青枯病、根结线虫病，为茄子保护地嫁接栽培中最主要的抗病砧木[1－2]。研究表明，野生茄托鲁巴姆叶片粗提物对茄子黄萎病具有较好的室内抑菌和盆栽防病效果[3－4]；粗提物对大葱菌核病菌、辣椒炭疽病菌、茄子黄萎病菌和黄瓜枯萎病菌4种病原真菌的菌丝生长和孢子萌发的抑制作用均较强[5]。

李云鹏[6]对野生茄托鲁巴姆叶片抑菌物质的提取条件做了单因素试验，认为在几种常用较高极性提取溶剂中，1∶1乙醇与丙酮为最佳提取溶剂，如果选择超声波提取，提取时间以0.5h较好，而在几种提取方式中，超声波提取表现出较好的提取效果。正交试验设计通过在正交表上安排试验可以使处理具有均匀分散性，以进行综合分析比较，达到以较少的试验次数得到最佳结果的目的[7]，因此，通过正交试验对植物提取物提取条件进行优化已成为较常用的方法。然而，目前尚未见通过正交试验设计，对野生茄托鲁巴姆叶片抑菌物质的提取条件进行优化的相关报道。

本文在前人对野生茄托鲁巴姆叶片提取物提取条件研究的基础上，通过设定提取溶剂、提取温度、提取时间、提取次数4个因素的正交试验，进行提取物制备，根据各提取物对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制效果，确定提取物抑菌物质的提取工艺。对野生茄托鲁巴姆叶片抑菌物质的提取条件进行正交试验优化，可为抑菌物质的进一步分离纯化提供理论依据，为野生茄托鲁巴姆叶片提取物的应用研究奠定基础，也可为其它植物提取物抑菌物质的提取条件研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

野生茄叶片材料：种植野生茄托鲁巴姆（Solanum torvum），当试材接近成熟期时采集叶片，清洗干净，于干燥箱内60℃烘干，粉碎过40目筛（孔径0.37mm）备用。

供试菌种：黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumarinum）由沈阳农业大学植物保护学院真菌室提供，在PDA培养基上继代培养后冰箱冷藏保存，临用前在PDA培养基上活化。

1.2 试验仪器

KQ-250B型超声波清洗器（苏州江东精密仪器有限公司）、RE-52D型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、SYQ.DSX-280A手提式不锈钢电热蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、SW-CJ-2G超净工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 提取物的制备

称取粉碎后的植物材料，加入植物干样重量5倍体积的提取溶剂，以超声波振荡提取，双层定性滤纸抽滤，上清液以相应的提取温度恒温旋转蒸发浓缩至干。然后以95%乙醇定容至1g（植物干样）／mL，作为提取物母液，于4℃冰箱保存备用，临用时进行适当稀释。

1.3.2 正交试验设计

为了系统考察野生茄托鲁巴姆叶片对黄瓜枯萎病菌抑菌活性物质的提取工艺，根据前人的单因素研究结果并参考其他植物提取物提取工艺设计，选取提取溶剂（A）、提取 温度（B）、提取 时间（C）、提取次数（D）作为考察因素，各设3个水平，进行L9（34）正交试验。各取野生茄托鲁巴姆叶片40g，共9份，精密称量，随机取样编号为1～9号，按每个试验号的要求进行粗提物的制备。以浓度为40g／L提取液进行试验，以提取物对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑菌直径为评价指标，筛选最佳提取工艺。因素水平表见表1。

表1 正交试验的因素和水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.3 生长速率法[8]测定提取物对菌丝生长的抑制作用

分别取4mL提取液加入96mL冷却到50～60℃的灭菌PDA培养基中（提取物浓度为40g／L），混合均匀后倒入直径为85mm的培养皿中，每处理3次重复，中央接入直径为0.722cm的供试菌饼，以95%乙醇为空白对照（CK）。恒温培养箱内28℃暗培养，观察菌落大小（根据对照生长情况确定测定时间），用十字交叉法测定菌落直径，计算菌落净生长量和抑菌直径及抑菌率：

1.3.4 最佳提取条件下不同浓度提取物对菌丝生长的抑制作用

为了验证正交试验最佳提取条件下提取物的抑菌效果，在最佳提取条件下进行提取，并将提取物分别稀释为浓度0.125、0.25、0.5、0.75、1g／mL（提取物终浓度分别为5、10、20、30、40 g／L），按1.3.3的方法测定提取物对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用。

1.4 数据统计分析方法

采用Microsoft Excel软件进行数据处理，用DPS统计软件以Duncan新复极差法进行显著性分析。

2 结果及分析

2.1 正交试验及方差分析结果

由表2可见，RB＞RC＞RA＞RD。由此可知，提取温度是影响提取效果的重要因素，其次为提取时间和提取溶剂，影响相对较小的因素是提取次数，说明野生茄托鲁巴姆叶片中的抑菌活性物质对温度较敏感。由K值和k值可知，A3优于A1和A2，B2优于B3和B1，C1优于C2和C3，D3优于D2和D1。因此初步得出，野生茄托鲁巴姆叶片抑菌物质的较好提取条件为A3B2C1D3。

将测得的抑菌直径进行方差分析（表3），结果表明，A、B、C、D 4个因素对提取物的抑菌直径均有极显著影响。对9个处理进行差异显著性分析，进一步证明，A3B2C1D3应作为最佳提取条件见表4。

表2 正交试验安排及结果Table2 Arrangments and results of orthogonal experiments

表3 抑菌直径方差分析结果表Table3 Variance analysis based on the inhibitory diameters of mycelial growth

表4 各个处理间差异显著性Table4 Significance analysis of different treatments

综上所述，得到野生茄托鲁巴姆叶片抑菌物质的最佳提取条件为以石油醚为提取溶剂，采用30℃超声波提取3次，每次提取15min。

2.2 最佳提取条件下提取物的抑菌活性

不同浓度最佳提取条件下提取物的抑菌作用见图1，由图1可见，随着提取物浓度的增加，对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用呈增强趋势，但浓度为20～40g／L时不同浓度提取物的抑菌作用相差不大，抑制率均＞70%。

图1 不同浓度提取物对黄瓜枯萎病菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of extracts from different concentration on Fusarium oxysporumf.sp.cucumarinum

3 讨 论

在进行植物提取物提取条件研究时，通常是在单因素试验基础上，通过正交试验进行提取条件优化，以确定具体提取物的提取工艺。利用正交试验研究提取物的最佳提取工艺的相关报道较多，彭友舜等[9]研究了芦笋茎中多糖的提取工艺，得到了超声波辅助提取笋茎多糖的最佳提取条件；杨晓帆等[10]得到了魔芋总生物碱的最佳提取条件为料液比1∶12，乙醇浓度85%，索氏提取4h；马丽娟等[11]研究表明，从蛇床子中提取抑制黄瓜枯萎菌的活性成分以在室温下95%乙醇连续超声提取3次，每次45min为宜。本试验表明，野生茄托鲁巴姆叶片中抑制黄瓜枯萎病菌菌丝生长的抑菌活性物质的最佳提取条件为以石油醚为提取溶剂，采用30℃超声波提取3次，每次提取15min。其中，提取溶剂的研究结果与李云鹏[6]对野生茄托鲁巴姆叶片抑制茄子黄萎病菌抑菌物质提取条件的单因素研究结果存在较大差异，可能与使用的靶标菌不同有关，也可能是受提取条件各因子间互作效应的影响。

本文以黄瓜枯萎病菌为供试菌种，研究了野生茄托鲁巴姆叶片抑菌活性物质的提取条件，由于同一提取物对不同病原真菌的抑菌效果可能不同[12]，即抑制一种病原真菌的抑菌活性物质可能对另一种病原真菌没有抑制作用。所以本试验结果对其它植物病原真菌是否同样适用，尚需进一步验证。

本试验表明，野生茄托鲁巴姆叶片的石油醚提取物中具有较强抑制黄瓜枯萎病菌的抑菌活性物质，可据此对提取物抑菌活性物质进行进一步分离纯化，以期获得抑菌物质纯品，同时可进行野生茄托鲁巴姆叶片石油醚提取物抑制黄瓜枯萎病的盆栽试验，以期为该提取物的应用提供更确凿的依据。

[1]杜晓荣，潘绍坤.野生茄托鲁巴姆成都地区露地繁种技术 [J].长江蔬菜，2008，（8）：33-34.

[2]徐本美，孙运涛，骆 明，等.茄子砧木——托鲁巴姆种子催芽剂的研究 [J].种子，2001，（4）：77-78.

[3]李之璞，周宝利，李云鹏.利用野生茄提取物控制栽培茄子黄萎病的研究 [J].辽宁农业科学，2007，（2）：34-35.

[4]李云鹏，周宝利，李之璞，等.野生抗病茄植株腐解物对茄子黄萎病的调控研究 [J].植物保护，2007，33（3）：50-52.

[5]李云鹏，尹玉玲，赵 宏，等.野生茄托鲁巴姆叶片提取物对园艺作物病原真菌的抑菌活性 [J].中国农学通报，2012，28（4）：120-124.

[6]李云鹏.野生茄对茄子黄萎病菌的化感作用及利用研究 [M].哈尔滨：黑龙江大学出版社，2009：40-49，53.

[7]邓振伟，于 萍，陈 玲.SPSS软件在正交试验设计、结果分析中的应用 [J].电脑学习，2009，（5）：15-17.

[8]方中达.植病研究方法 [M].北京：中国农业出版社，1998：151-154.

[9]彭友舜，宋士涛，廉 琪，等.超声波辅助提取芦笋茎中多糖工艺的优化 [J].安徽农业科学，2011，39（5）：2645-2646.

[10]杨晓帆，王 红，王 芳，等.魔芋总生物碱量的测定 [J].光谱实验室，2011，28（1）：153-156.

[11]马丽娟，周宝利，张淑红，等.蛇床子提取物对黄瓜枯萎病菌抑制效果的研究 [J].植物保护，2008，34（4）：36-39.

[12]Qasem J R and Abu-blan.Antifungal activity of aqueous extracrs from some common weed species [J].Application Biology，1996，128：533-540.