穿心莲给药后大鼠粪便处理方法的考察

宋 辉，杨 波，王学志，白 晶，李文兰

（1.哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076；2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076；3.哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076）

0 引 言

传统中药使用方法以口服剂型为主，药物中的有效成分在进入消化道之后，除了消化系统的消化作用外，还不可避免地与肠道菌群发生代谢关系。由于受粪便的吸附作用和肠内菌落的代谢速率影响，这些化学成分的原型及代谢产物在消化道中会有残留；同时一些药物在体内不能通过肾脏代谢，经过胆汁排泄到肠道中随粪便排出体外，所以，进入体内的绝大部分药物都能在粪便中检测到。因此，通过分析鉴定粪便中的化学成分也能够间接地反映中药药效物质构成。

中药穿心莲是爵床科植物穿心莲Andrographispaniculata（burm.f.）Nees的地上部分，具有清热解毒、凉血消肿的功效。现代药理研究法表明穿心莲具有清热抗炎、抗心血管疾病、抗感染、抗氧化、抗生育、抑制肿瘤细胞生长等多种药理作用[1－5]，作为抗病毒中药广泛应用于临床。研究发现，穿心莲对雄性大鼠精子的形成具有显著性影响，雌鼠不易受孕[6－7]，具有一定的生殖毒性。为了从体内过程追踪其药效物质基础，分析大鼠口服给药后粪便的成分，寻找成分间的相互作用规律，本实验对粪便的处理方法进行优化，以期减少粪便中内源性物质的干扰，获取更多入粪的成分信息，初步分析粪便中成分的来源，为下一步粪便中的成分分析及其生殖毒性物质基础揭示提供科学理论的依据。

1 实验材料

1.1 仪 器

Waters高效液相（HPLC）系统（W2695泵、W2996DAD检测器、自动进样器、Empower化学工作站）；分析天平（ALC-110.4上海人和科学仪器有限公司）；恒温水浴（DK80上海一恒科技有限公司）；台式低温离心机（Avanti 30美国BECKMAN）；超声震荡仪（H66MC美国奥好斯科技有限公司）；电热恒温水浴锅（DK-80上海一恒科技有限公司）；XW-80A型快速蜗旋器。

1.2 药品和试剂

穿心莲 [Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees.]（哈尔滨市盛泰中药饮片加工厂，批号：080501）。乙腈、甲醇（色谱纯，山东禹王）；甲酸（色谱纯，上海科锐）；自制超纯净水等。

1.3 动 物

Wistar雄性大鼠（由哈尔滨医科大学动物中心提供），体重180～240g，批号SCXK-（黑）2006-2010。

2 实验方法

2.1 灌胃溶液的制备

精密称取100g穿心莲全叶药材，95%乙醇3倍量温浸2h后，回流提取3次。每次的回流时间及溶剂用量分别为第一次10倍量提取1.5h、后2次用7倍量提取1h，合并提取液，55℃左右减压回收乙醇，浓缩至1／3体积。保存于冰箱备用。实验时用蒸馏水溶解，制成相当于生药8g／mL的灌胃药液备用[7]。

2.2 体外药材溶液的制备

称取浸膏（1g生药材），甲醇充分溶解，定容至10mL容量瓶，过0.45μm滤膜，得待测溶液。

2.3 对照品溶液的制备

分别称取穿心莲内酯1mg、脱水穿心莲内酯1 mg，甲醇充分溶解，定容至10mL的容量瓶，过0.45μm滤膜，得混合标准品溶液。

2.4 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry ShieldTM RP18（3.9mm×150mm，5μm）；保护柱：Nova-PakC18Guard-PakTM；进样量：20μL；流动相：乙腈-0.2%甲酸水溶液洗脱系统；流速：0.8mL／min；柱温：30℃；检测波长：275nm。流动相梯度变化程序见表1。

表1 流动相梯度变化程序表Table1 Gradient elution program of mobile phases

2.5 空白及含药粪便的收集

取Wistar大鼠4只，称重，给药组按照依据8 g生药／100g剂量灌胃，即1mL／100g给予灌胃药液，空白组给予相应体积的蒸馏水，每次间隔12h，连续给药3d，于末次给药后放入代谢笼中，收集0～24h粪便，置于－20℃冰箱中冷冻保存，备用。

2.6 粪便样品处理方法考察

针对粪便中化学成分的复杂性，并且极性大的成分较多，以及粪便中内源性成分的干扰，本实验采取以下3种方法对粪便进行预处理。

1）SPE固相萃取法 取大鼠给药组粪便混合，用研钵研碎，称取2.0g，加10倍量甲醇超声提取30min，2次，滤过，减压回收甲醇至干，用2mL色谱甲醇溶解，0.22μm微孔滤膜过滤，取1mL过滤液上SPE小柱纯化，用2mL甲醇与1mL乙腈洗脱，合并洗脱液，减压回收至干，残渣用1mL色谱甲醇溶解，0.22μm微孔滤膜过滤为含药粪便供试品溶液；同法制备空白粪便供试品溶液。

2）乙酸乙酯萃取法 取大鼠给药组粪便混合，用研钵研碎，称取2.0g，加10倍量甲醇超声提取30min，2次，滤过，减压回收甲醇至干，用4 mL蒸馏水溶解，用2倍量乙酸乙酯萃取2次，取乙酸乙酯层，减压回收至干，用0.75mL甲醇超声溶解，0.22μm微孔滤膜过滤为含药粪便供试品溶液；同法制备空白粪便供试品溶液。

3）正丁醇萃取法 取大鼠给药组粪便混合，用研钵研碎，称取2.0g，加10倍量甲醇超声提取30min，2次，滤过，减压回收甲醇至干，用4 mL蒸馏水溶解，每次加2倍量水饱和的正丁醇溶液，萃取3次，合并萃取液，减压回收至干，用1.0mL色谱甲醇超声溶解，0.22μm微孔滤膜过滤为含药粪便供试品溶液；同法制备空白粪便供试品溶液。

根据以上3种方法，筛选出处理步骤最少且杂质峰较少、峰形较好的粪便处理方法。

2.7 粪便样品HPLC图谱的测定

分别吸取含药粪便供试品溶液及空白粪便供试品溶液各20μL、体外药材溶液及对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录70min的色谱图。

3 结果与讨论

3.1 最佳粪便样品处理方法

通过分析乙酸乙酯萃取法液相色谱图（图1）可知，乙酸乙酯对于极性较弱的成分吸收选择性较好，对于强极性成分选择性差，导致较多成分丢失，检测到的成分太少，不符合实验要求。

通过分析正丁醇萃取法液相色谱图（图2）可知，水饱和正丁醇提取法提取的成分在当前液相条件下分离度较差，成分也较少，不符合实验要求。

通过分析SPE固相萃取法的液相图谱（图3），并与正丁醇萃取法和乙酸乙酯萃取法进行对比可以发现，固相萃取法的选择性好，提出成分多，引入杂质少，对样品起到了很好的纯化作用，可作为含药粪便的处理方法。

3.2 体内粪便HPLC图谱的建立

对比含药粪便、空白粪便、体外药材及对照品的HPLC图谱（图4）可以发现，在含药粪便中发现19个成分，通过对比逐个峰的色谱图与光谱图，结果显示，3、5、7、8、12、15、16、17、18、19号峰为原型成分，1、2、4、6、9、10、11、13、14号峰推测其为体内代谢产物；与对照品对比发现，12号峰为脱水穿心莲内酯。

4 结 论

目前对穿心莲的药效作用研究比较广泛，但研究大多限于其解热、抗菌、抗炎等药理学作用。关于穿心莲的生殖毒性及其物质基础，至今尚未见翔实的研究报道。本实验在前期实验已明确具有生殖毒性的剂量下给药3d后的粪便成分进行分析，筛选出最佳粪便处理方法，建立穿心莲粪便指纹图谱，为下一步利用质谱技术分析其成分，代谢途径及其结构演变提供支持，结合同步进行的该药材在血液及尿液中成分分析，揭示其生殖毒性的物质基础，从而为优化穿心莲临床使用的正确用法、用量，增强用药的安全性提供参考依据。

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