雌激素对子宫内膜细胞凋亡的影响及其机制探讨

翟永宁，仲 丹，张 蕾，吴王飞，卢 莹，周 静，沈宇飞

(南京医科大学附属南京妇幼保健院，南京210004)

正常情况下子宫内膜组织仅存在于子宫内，若其植入机体其他部位并生长即称为子宫内膜异位症［1］。Kitawaki等［2］研究证实，子宫内膜异位症的发生、发展与雌激素密切相关，是一种雌激素依赖性疾病。顾玲芬等［3］研究证实，异位内膜生物学特性不同于在位内膜，可能与其发病机理及局部激素环境有关。而子宫内膜异位症发生的家族聚集性，也提示该病的发生有遗传性［4］。有研究通过构建在位内膜和异位内膜差异基因cDNA文库筛选差异表达基因，发现前列腺特异性酸性磷酸酶(PSAP)基因在子宫内膜异位症患者子宫内膜中呈高表达［5］。2009年1月～2012年12月，我们观察了雌激素对子宫内膜细胞凋亡的影响，并探讨其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料 正常子宫内膜标本均取自南京妇幼保健院就诊、因子宫肌瘤切除子宫的患者，并排除其他全身性及内分泌性疾病。雌激素(E2257)购自美国Sigma公司，RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国 Gibco公司，Trizol试剂、空载体 pGPU6/GFP/Neo购自美国Invitrogen公司，逆转录(RT)试剂盒、定量PCR检测试剂盒购自日本TOYOBO公司，内切酶BamHⅠ和 BbsⅠ购自宝生物工程(大连)有限公司。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养与分组 将子宫内膜标本置于含有10%FBS和DMEM的培养液中，于37℃、5%CO2条件下培养;细胞经胰酶消化后以每孔2×106接种于6孔板，每组3个复孔。将标本随机分为C组及 E8、E7、E6 组，C 组不加雌激素，E8、E7、E6 组细胞贴壁后分别加入浓度为 10－8、10－7、10－6mmol/L的雌激素。

1．2．2 子宫内膜细胞周期和凋亡检测 采用流式细胞术。用胰酶消化每组细胞，1 000 r/min离心5 min后弃上清;用预冷的PBS洗1遍，离心后留少量PBS;弹匀后加入细胞固定液，4℃固定10 h;离心5 min，吸出上清，残留少量固定液，加入预冷的PBS洗1遍;配制新鲜碘化丙啶染色液，每管细胞加入500μL;缓慢并充分重悬细胞，37℃避光温浴30 min后上流式细胞仪，激发波长488 nm下检测红色荧光，同时检测光散射情况。每组细胞同时各用两种gate(gate1和gate2)进行检测，以进行各组间凋亡情况的比较。

1．2．3 PSAP基因表达量检测 子宫内膜细胞在雌激素作用下培养3 d，采用Real-time PCR法检测每组样本中PSAP基因表达量。用Trizol试剂进行RNA提取，提取后的RNA采用微量分光光度计法进行样本浓度测定，采用 TaKaRa kit Cat(NO．DRR037A)逆转录合成cDNA。PSAP基因上游引物5'-GCAAGCCCCAGCCAAAGGATAATG-3'，下游引物5'-AGGGCCCAGGCGGTCACACTC-3'，PCR 引物扩增长度146 bp。染料法荧光定量PCR反应条件:94℃、3 min，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共 35个循环。72℃检测荧光信号。每组同时检测PSAP基因和内参18 S基因，每组PSAP基因表达量=PSAP基因的拷贝数/参考基因的拷贝数。

1．2．4 基因干扰后子宫内膜细胞凋亡及PSAP基因表达量检测 PSAP基因干扰载体的构建:PSAP基因shRNA模板中的loop结构选用了TTCAAGAGA以避免形成终止信号，shRNA的转录终止序列采用T6结构;正义链模板的5'端添加了CACC，与BbsⅠ酶切后形成的黏端互补，反义链模板的5'端添加了GATC，与BamHⅠ酶切后形成的黏端互补，如果shRNA的第一个碱基不是G，则在CACC后补加1个G;将pGPU6/GFP/Neo载体用BamHⅠ和BbsⅠ进行酶切使之线性化，将酶切后的载体与shRNA进行连接，形成pGPU6/GFP/Neo-shRNA，并进行酶切鉴定，阳性重组载体再进行测序鉴定。将pGPU6/GFP/Neo-shRNA转染至培养的子宫内膜细胞中，培养 3 d，按照 1．2．2、1．2．3 的方法检测干扰前后子宫内膜细胞凋亡和PSAP基因表达量。

1．2．5 统计学方法 采用STATA11．0统计软件。计量资料以¯x±s表示，组间比较采用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组子宫内膜细胞凋亡及PSAP基因表达量比较 见表1。

2．2 基因干扰后子宫内膜细胞凋亡及PSAP基因表达量比较 干扰前后进入G0/G1期的子宫内膜细胞比分别为26．4% ±1．7%、40．4% ±3．7%，进入S期的子宫内膜细胞比分别为68．4% ±4．3%、48．0% ±3．2%，P 均 ＜0．05。干扰前后子宫内膜细胞凋亡率分别为 18．2% ±1．3%、10．2% ±0．7%，PSAP 基因表达量分别为50．4 ±3．2、19．2 ±1．3，P 均＜0．05。

表1 各组子宫内膜细胞凋亡率、周期及 PSAP表达量比较(¯x±s)

3 讨论

子宫内膜异位症是指子宫内膜的腺体和间质生长在子宫腔以外的病症，发病年龄为25～45岁，发病率为10% ～15%，近年来呈明显增高趋势，给广大女性患者造成极大痛苦［6，7］。其发病机制尚未完全明确，当前的研究重点集中在子宫内膜异位症形成的相关基因［8］。既往的研究并未发现某一明确的基因与该病的发生有根本性的作用;近期基因芯片的研究提示，PSAP基因在子宫内膜异位组织中高表达，提示该基因在子宫内膜异位症的发生、发展中存在着一定的作用。近来研究发现，PSAP基因在人乳腺癌及卵巢癌细胞中与procathepsin D相互作用［9］，在肿瘤的侵蚀及转移中发挥作用，而且表达受到雌激素的影响。有研究发现，PSAP基因在成年及胚胎的生殖系统中是高表达的［10，11］。在PSAP基因敲除的突变小鼠中，性腺的体积和质量都减少，表明其在生殖系统中起着重要的作用，可能涉及到生殖器官的生长、维持及其细胞的分化;同时该研究也证实，PSAP基因在子宫内膜中特异表达，在子宫内膜异位病灶中高表达，进一步证实了PSAP基因在子宫内膜异位症发生中具有一定的作用［12］。

本研究发现，雌激素浓度的增加，E8和E7组的细胞凋亡率(gate1)无明显差别，但在增加雌激素浓度后，子宫内膜细胞的凋亡率又再次增加;而PSAP基因的表达随雌激素浓度的增加，呈一种“V”形改变，先是逐渐降低，后又增加，似乎雌激素浓度的增加，触发了PSAP基因表达的阈值。在正常人，雌激素的分泌有其自然周期，绝经后雌激素的分泌减少，子宫内膜异位症也可以自愈了。在基因干扰后，进入G期的细胞增多，进入S期的细胞减少，因此细胞凋亡明显减少。雌激素浓度的改变造成细胞凋亡的变化，可能与雌激素受体的过表达也有关系。有研究证实，雌激素受体过表达可以同时以配体非依赖性和配体依赖性的方式抑制细胞增殖和增加细胞凋亡［13］。因此，在子宫内膜异位症中，PSAP基因介导的细胞凋亡增加，可能与子宫内膜异位病灶的形成、增大有一定的关系。

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