淫羊藿素、脱水淫羊藿素对T淋巴细胞的比较研究

赖新强，黄秀艳，曾耀英

(暨南大学1.分析测试中心;2.生命科学技术学院组织移植与免疫中心，广东 广州 510632)

淫羊藿(Epimedium Kereanum Nakai)，系小檗科(Berberidaceae)淫羊藿属(Epimedium)植物.作为中药，淫羊藿不仅可以补肾阳、强筋骨、祛风湿，而且还有抗衰老、提高免疫功能、抑制肿瘤等功效［1］.淫羊藿含有多种成分，其主要活性成分为淫羊藿甙(icariin)，本研究小组前期发现淫羊藿甙联合环孢菌素A能抑制移植造成的免疫排斥反应，淫羊藿甙通常经口服途径进入体内，首先被代谢为淫羊藿次甙(icarisideⅡ)，并在胆汁中积累，后经肠道细菌分解会产生多种代谢产物［2-5］，主要是淫羊藿素(icaritin，ICA)与脱水淫羊藿素(anhydroicaritin，AHI).目前，关于 AHI的研究报道甚少，只有体外促分化［6-7］、矿化［8］，抗氧化［9］等研究，本研究为比较两种代谢产物对小鼠T淋巴细胞免疫功能的影响.

1 材料和方法

1.1 主要材料

清洁级BALB/c近交系小鼠，雌性，6～8周龄，体质量(18～22)g，购自广东省实验动物中心，动物证号:SCXK(粤)2008-0002.脱水淫羊藿素、淫羊藿素购自北京珅奥基医药科技有限公司.刀豆蛋白(concanavalin A，con A)、钙离子刺激剂 ionomycin(ION)、thapsigargin(TG)购自美国 Sigma公司.RPM I 1640培养基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、L-谷氨酰胺(glutamine，Gln)、β-二巯基乙醇(2-mercapto-ethanol)、质量浓度均为100 mg/L青霉素与链霉素购自美国Gibco-BRL公司.细胞周期染液PI/RNase，抗小鼠 CD3-PE、CD3-FITC、CD69-FITC、CD25-PE单克隆抗体(mAb)，Cytometric Bead Array(CBA)Mouse Inflammation Kit购自美国BD-PharM-ingen公司.CCK-8试剂盒购自日本DOJINDO公司.FACSAria流式细胞仪为美国Becton Dickinson产品.钙离子指示剂Fluo4-AM和助溶剂Pluronic F-127，细胞增殖染料Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester(CFDA-SE)购自美国Invitrogen公司.

1.2 主要方法

(1)小鼠淋巴细胞的分离与培养 分离BALB/c小鼠淋巴结，研磨，通过200目尼龙网得到单个细胞.用PBS洗涤细胞2次，计数，重悬于RPMI-1640培养基(含体积分数为10%胎牛血清，质量浓度均为100 mg/mL青霉素、链霉素，浓度为2 mmol/L L-谷氨酰胺和浓度为50 μmol/L 2-巯基乙醇).淋巴细胞接种到96孔板(200 μL/孔，密度为3×106/mL)，37℃，体积分数为5%CO2培养.

(2)AHI、ICA对淋巴细胞毒性的检测 分别设置2个对照组:空白对照组(单纯RPMI1640完全培养基)、对照组(细胞悬液未加药物刺激);设置6个实验组:加药组(终浓度分别为2.5、5、10 μmol/L的AHI、ICA);且每组分别设置3个重复.细胞接种，分别加入50 μL不同浓度的AHI、ICA(终浓度为2.5、5、10 μmol/L)，每孔的总体积为100 μL，培养48 h后，按照试剂盒说明书，每孔加入10 μL的CCK-8，混匀，继续培养4 h;酶标仪检测(单波长450 nm，中速，10 s)，并计算细胞相对存活率.细胞相对存活率=［(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)］×100%.

(3)AHI、ICA对T淋巴细胞早期活化的检测分别设置对照组(细胞悬液未加药物刺激)、conA组、conA+2.5 μmol/L 组、conA+5 μmol/L 组、conA+10 μmol/L组，其中 conA的终质量浓度均为5 mg/L，且每组分别设置3个重复.细胞接种，分别加入100 μL 不同浓度的 AHI、ICA(终浓度为 2.5、5、10 μmol/L)，每孔的总体积为200 μL，培养4 h，加入conA(终质量浓度为5 mg/L)，继续培养6 h后，收集细胞，PBS洗涤，转入流式管中，加入抗小鼠CD3-PE、CD69-FITC单克隆抗体，避光染色30 min，洗涤，重悬后立即行流式细胞术检测，分析 CD3 CD69双阳性细胞群的百分数.

(4)AHI、ICA对T淋巴细胞中期活化的检测分别设置对照组(细胞悬液未加药物刺激)、conA组、conA+2.5 μmol/L 组、conA+5 μmol/L 组、conA+10 μmol/L组，其中 conA的终质量浓度均为5 mg/L，且每组分别设置3个重复.细胞接种，分别加入100 μL 不同浓度的 AHI、ICA(终浓度为 2.5、5、10 μmol/L)，每孔的总体积为200 μL，培养4 h，加入conA(终质量浓度为5 mg/L)，继续培养24 h后，收集细胞，PBS洗涤，转入流式管中，加入抗小鼠CD25-PE、CD3-FITC单克隆抗体，避光染色30 min，洗涤，重悬后立即行流式细胞术检测，分析 CD3 CD25双阳性细胞群的百分数.

(5)AHI、ICA对T淋巴细胞增殖的检测 1.0×107/mL淋巴细胞 CFSE(1 μmol/L)染色标记37℃，10 min，用含体积分数为10%FBS的 PBS洗2次，悬浮于完全培养基.分别设置对照组(细胞悬液未加药物刺激)、conA 组、conA+2.5 μmol/L 组、conA+5 μmol/L 组、conA+10 μmol/L 组，其中 conA的终质量浓度均为5 mg/L，且每组分别设置3个重复.细胞接种，分别加入100 μL不同浓度的AHI、ICA(终浓度为 2.5、5、10 μmol/L)，每孔的总体积为200 μL，培养4 h，加入 conA(终质量浓度为5 mg/L)，继续培养48 h或72 h后，收集细胞，PBS洗涤，转入流式管中，立即行FCM检测和分析(FITC通道)，结果使用ModFit软件分析.

(6)AHI、ICA对T淋巴细胞周期的检测 分别设置对照组(细胞悬液未加药物刺激)、conA组、conA+2.5 μmol/L 组、conA+5 μmol/L 组、conA+10 μmol/L组，其中conA的终质量浓度均为5 mg/L，且每组分别设置3个重复.细胞接种，分别加入100 μL 不同浓度的 AHI、ICA(终浓度为 2.5、5、10 μmol/L)，每孔的总体积为200 μL，培养4 h，加入conA(终质量浓度为5 mg/L)，继续培养48 h后，收集细胞，转入流式管中，体积分数为70%酒精固定30 min以上，离心，PBS洗涤2次，加入细胞周期染液PI/RNase，避光染色30 min，300目尼龙网过滤，立即行FCM检测和分析(PI通道)，结果使用ModF-it软件分析.

(7)AHI、ICA对T淋巴细胞钙离子内流的检测分离的淋巴细胞(4.0×107/mL)加入终浓度为2.5 μmol/L的钙离子指示剂Fluo-4/AM，37℃染色30 min.然后洗2次，并重悬于无钙的Locke's缓冲液(浓度分别为145 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2.6 mmol/LCaCl2， 1 mmol/L MgCl2， 10 mmol/L HEPES-Na，及5.6 mmol/L葡萄糖用 HCl调试 pH=7.4)，细胞密度为4.0 ×106/mL.细胞预孵育药物10 min.之后，加入 ION(浓度 2.5 μmol/L)或 TG(浓度2.5 μmol/L)刺激.细胞内储存的钙释放后，加入2 mmol/L的钙溶液，形成细胞外钙涌入胞内.整个过程用流式细胞仪FACSCAria(Becton Dickinson)检测，Fluo-4的荧光发射，在FL-1通道.数据分析用软件 FlowJo4.0(Tree Star，San Carlos，CA).

(8)AHI、ICA对T淋巴细胞分泌细胞因子的检测 分别设置对照组(细胞悬液未加药物刺激)、conA组、conA+5 μmol/L组，其中conA的终质量浓度均为5 mg/L，且每组分别设置3个重复.细胞接种，分别加入200 μL终浓度为 5 μmol/L的 AHI、ICA，每孔的总体积为400 μL，培养4 h，加入conA(终质量浓度为5 mg/L)，继续培养12 h后，取出细胞的培养上清50 μL，按照CBA试剂盒说明书做标准曲线和加入试剂，用流式细胞仪检测，获得的数据用FCAP array软件进行分析.

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 AHI、ICA对淋巴细胞毒性的影响

CCK-8比色法检测结果显示:浓度为2.5、5、10 μmol/L的 AHI细胞存活率分别为(99.66±1.21)%，(98.44 ±1.51)%，(97.31 ±0.37)%，与对照组相比，无统计学差异;2.5、5、10 μmol/L 的ICA 细胞存活率分别为(98.69 ±1.33)%，(97.18±1.54)%，(95.80 ±0.21)%，与对照组相比，无统计学差异，说明AHI、ICA药物在设计的浓度范围内对淋巴细胞无明显的毒副作用.

2.2 AHI、ICA对T淋巴细胞活化的影响

结果显示:与conA组比较，各种浓度的AHI能明显抑制T淋巴细胞的早期活化(CD3+CD69+)，且呈剂量依赖关系;各种浓度的ICA能显著抑制T淋巴细胞的早期活化.与conA组比较，高浓度的AHI能抑制T淋巴细胞的中期活化(CD3+CD25+);各种浓度的ICA能显著抑制T淋巴细胞的中期活化，且呈剂量依赖关系，结合早期活化的结果，ICA表现出一定的时间依赖关系(图1).

图1 AHI或ICA对T淋巴细胞活化的影响Fig.1 Flow cytometry analysis of the effect of AHI/ICA on the activation of the mouse lymphocytes

2.3 AHI、ICA对T淋巴细胞增殖的影响

结果显示:与空白组比较，静止状态的小鼠淋巴细胞经conA刺激48 h后，显著增殖(P＜0.01)，与conA组比较，浓度2.5 μmol/L的 AHI无统计学差异，浓度5 μmol/L的AHI能抑制T细胞增殖(P＜0.05)，浓度 10 μmol/L 的 AHI能显著抑制 T 细胞增殖(P＜0.01)，表现出明显的浓度依赖性;浓度2.5 μmol/L的 ICA 能抑制 T 细胞增殖(P ＜0.05)，浓度5、10 μmol/L的ICA均能显著抑制T细胞增殖(P＜0.01)，表现出明显的浓度依赖性.72 h后，与conA组比较，浓度2.5 μmol/L的 AHI仍没有统计学差异，浓度5 μmol/L的AHI继续抑制T细胞增殖(P ＜0.05)，浓度 10 μmol/L 的 AHI继续显著抑制T细胞增殖(P＜0.01)，表现出明显的浓度依赖性;浓度2.5 μmol/L的ICA没有统计学差异，浓度5 μmol/L的ICA继续抑制T细胞增殖(P＜0.05)，浓度10 μmol/L的ICA继续显著抑制T细胞增殖(P＜0.01)，表现出明显的浓度依赖性(图2).

图2 AHI或ICA对T淋巴细胞增殖的影响Fig.2 Proliferation index of lymphocytes for CFSEstaining in response to conA for 48 h or 72 h

2.4 AHI、ICA对T淋巴细胞周期的影响

结果显示:与空白组比较，静止状态的小鼠淋巴细胞经conA刺激48 h后，G0/G1期细胞含量显著下降(P ＜0.01)，与 conA 组比较，浓度 2.5、5 μmol/L的AHI没有统计学差异，浓度10 μmol/L的AHI能阻滞在G0/G1 期(P ＜0.05);浓度2.5 μmol/L 的ICA没有统计学差异，浓度5 μmol/L的ICA能阻滞在 G0/G1期(P ＜0.05)，浓度10 μmol/L 的 ICA 能显著阻滞在G0/G1期(P＜0.01)，表现出明显的浓度依赖性(图3).

2.5 AHI、ICA对T淋巴细胞钙离子内流的影响

由图4显示，在无钙情况下，阻断剂TG，离子霉素ION都会引起钙库释放.随着钙库清空，钙水平恢复到基础值.添加钙离子后，胞外钙通过开放的钙离子通道进入，导致胞内钙水平显著升高.与对照组比较，5 μmol/L AHI预处理抑制钙库释放不明显，主要抑制ION刺激后的外钙内流过程(P＜0.05);5 μmol/L ICA预处理能显著抑制TG或ION刺激的钙库释放，以及外钙内流过程(P＜0.01).

图3 AHI或ICA对T淋巴细胞周期的影响Fig.3 Incubation of different concentrations of AHI/ICA for 48 h induced G0/G1 phase cell cycle Proliferation index of lymphocytes for CFSEstaining in response to conA for 48 h or 72 h arrest in conA-induced lymphocytes

图4 AHI或ICA对T淋巴细胞钙离子内流的影响Fig.4 Effects of AHI/ICA on different stirnuli-induced Ca2+release from intracellular stores(first peak)and Ca2+influx(second influx)

2.6 AHI、ICA对T淋巴细胞分泌细胞因子的影响

由 CBA 的标准品所得的 IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF和IL-12p70 5种细胞因子的标准曲线及回归方程，并分别计算5种细胞因子的释放量.结果由图5显示:与空白组比较，conA刺激分泌的各种细胞因子显著增高(P＜0.01);与 conA组比较，5 μmol/L的AHI能抑制活化淋巴细胞分泌IL-6(P＜0.05)、IL-10(P＜0.05)，AHI能显著抑制活化T淋巴细胞分泌 IFN-γ(P ＜0.01)、TNF(P ＜0.01)和 IL-12p70(P＜0.01);5 μmol/L的ICA能抑制活化淋巴细胞分泌 IL-6(P ＜0.05)、IL-10(P ＜0.05)，ICA 能显著抑制活化T淋巴细胞分泌IFN-γ(P＜0.01)、TNF(P ＜0.01)和 IL-12p70(P ＜0.01).

图5 AHI或ICA对T淋巴细胞分泌细胞因子的影响Fig.5 CBA analysis of the effect of AHI/ICA on inflammatory cytokines secretion from conA-stimulated lymphocytes

3 讨论

本研究的结果显示脱水淫羊藿素(AHI)与淫羊藿素(ICA)对活化的小鼠T淋巴细胞具有明显的免疫抑制作用，特别是ICA，能明显抑制经con A刺激的T淋巴细胞早中期活化，增殖，钙离子内流，并阻滞细胞周期在G0/G1期，以及分泌IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF和IL-12p70 5种细胞因子.

T淋巴细胞的活化涉及许多分子的表达，其中CD69是早期活化分子.CD69一旦表达，将作为T细胞活化和增殖的共刺激分子［10］.CD25是T细胞中期活化分子，也是IL-2受体(IL-2R)α链，与IL-2Rβ、IL-2Rγ链共同组成 IL-2R，，与 IL-2结合后刺激活化的 T 细胞进行扩增［11］.Li等［12］研究了 ICA对脾脏T细胞活化的影响，无论是用conA，还是用anti-CD3刺激，发现ICA均能减少CD4+T细胞的CD25水平(P＜0.05).本研究结果表明:ICA能显著抑制T淋巴细胞的中期活化，呈浓度依赖关系，结果与Li等的一致.本实验中，ICA还能显著抑制T淋巴细胞的早期活化，结合中期活化的结果，ICA表现出一定的时间依赖关系;而AHI只能明显抑制T淋巴细胞的早期活化，且呈浓度依赖关系.

Li等［12］研究了 ICA对脾脏 T细胞分泌 IFN-γ的影响，发现ICA能减少脾脏T细胞的IFN-γ水平，具有明显的浓度依赖性.本实验的ICA能显著抑制活化T淋巴细胞分泌IFN-γ，结果与Li等的一致.Zhou等［13］比较了淫羊藿苷(icariin)和淫羊藿素(icaritin)对髓系衍生抑制细胞分泌细胞因子的影响，发现两者均能减少分泌 IL-6、IL-10、TNF-α.本实验的ICA能抑制活化T淋巴细胞分泌IL-6、IL-10、TNF，结果与Zhou等的一致.IL-12由p35、p40两个亚基组成，一起组成有活性的IL-12p70，IL-12对于产生IFN-γ是必需的，从而诱导Th1细胞分化.本实验的ICA能显著抑制活化T淋巴细胞分泌IL-12p70，因此，ICA可能抑制了Th1细胞的分化，进而显著减少了IFN-γ，而Th2型的细胞因子IL-6，IL-10仅部分减少.据此，ICA可能通过抑制Th1细胞分化，抑制Th1细胞介导的细胞免疫，而促进Th2细胞产生IL-6、IL-10，或者促进 Tr1、Treg细胞产生 IL-10，增强Th2细胞介导的体液免疫.AHI对细胞因子的影响与ICA相似，可能具有相似的机制，需要进一步用实验证实.

［1］ WU H，LIEN E J，LIEN L L.Chemical and pharmacological investigations of Epimedium species:a survey［J］.Prog Drug Res，2003，60:1-57.

［2］ 滕 菲，曾耀英，黄秀艳，等.淫羊藿甙对小鼠同种异基因皮片移植的影响［J］.暨南大学学报:自然科学与医学版，2009，30(04):403-407.

［3］ 张 依，姚志红，秦子飞，等.LC-MS/MS测定家兔胆汁中淫羊藿次苷Ⅱ［J］.暨南大学学报:自然科学与医学版，2012，33(3):305-310.

［4］ 刘子琛，徐 英，陈世忠.淫羊藿次苷Ⅰ在大鼠体内的药动学和组织分布研究［J］.中国药学杂志，2008，43(11):848-851.

［5］ 赵艳红，贾晓斌，陈 彦，等.淫羊藿黄酮类化合物的大鼠在体肠吸收研究［J］.中国药学杂志，2008，43(3):188-191.

［6］ 翟远坤，李志忠，陈克明，等.淫羊藿素和脱水淫羊藿素对骨髓间充质干细胞成骨性分化影响的比较研究［J］.中国药学杂志，2011，46(11):837-842.

［7］ LI Y，ZHANG X，PENG H，et al.Effects of anhydroicaritin and 2″-hydroxy-3″-en-anhydroicaritin on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 osteoblasts［J］.Nat Prod Commun，2012，7(11):1461-1464.

［8］ 宋 鹏，姚 娟，马慧萍，等.脱水淫羊藿素与山柰素对体外培养成骨细胞成熟矿化影响的比较研究［J］.药学学报，2012，47(7):890-896.

［9］ 包 宇，杨建雄，孙润广.淫羊藿苷与脱水淫羊藿素的体外抗氧化研究［J］.陕西师范大学学报:自然科学版，2012，40(3):67-70.

［10］ TESTI R，AMBROSIO D D，MARIA R D，et al.The CD69 receptor:a multipurpose cell surface trigger for hematopoietic cells［J］.Immunol Today，1994，15(10):479-483.

［11］ GONZALEZ-GARCIA A，MERIDA I，MARTINEZ A C，et al.Intermediate affinity interleukin-2 receptor mediates survival via a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway［J］.J Biol Chem，1997，272(15):10220-10226.

［12］ LI X，HU Y，HE L，et al.Icaritin inhibits T cell activation and prolongs skin allograft survival in mice［J］.Int Immunopharmacol，2012，13(1):1-7.

［13］ ZHOU J，WU J，CHEN X，et al.Icariin and its derivative，ICT，exert anti-inflammatory，anti-tumor effects，and modulate myeloid derived suppressive cells(MDSCs)functions［J］.Int Immunopharmacol，2011，11(7):890-898.