莠去津对中华绒螯蟹蜕皮激素分泌的影响

焦满静，曹佳培，陈勤娜，刘蓓蓓，康现江

（河北大学生命科学学院，河北保定 071002）

莠去津对中华绒螯蟹蜕皮激素分泌的影响

焦满静，曹佳培，陈勤娜，刘蓓蓓，康现江

（河北大学生命科学学院，河北保定 071002）

为了研究除草剂莠去津对中华绒螯蟹蜕皮激素分泌的影响，利用不同质量浓度（0.001，0.01，0.1，1mg／L）的莠去津对中华绒螯蟹进行染毒处理，采用酶联免疫吸附技术（ELISA）分析其对中华绒螯蟹血清蜕皮激素含量的影响.结果表明：低质量浓度（0.001，0.01mg／L）以及高质量浓度（1mg／L）莠去津暴露后，中华绒螯蟹血清中蜕皮激素含量相较对照组无显著变化，而中间质量浓度0.1mg／L的蜕皮激素含量则显著低于对照组，该质量浓度下中华绒螯蟹的蜕皮会受到一定的影响.

莠去津；中华绒螯蟹；蜕皮激素

莠去津（atrazine，ATR）是目前中国使用量较大的除草剂种类之一，其化学名称2－氯－4－乙胺基－6－异丙胺基－1，3，5－三嗪，又名阿特拉津、莠去尽、阿特拉嗪、园保净.ATR具有较大的极性，易被雨水淋洗至土壤较深层，造成地表水和地下水污染.作为一种内分泌干扰物（endocrine－disrupting chemicals，EDCs），ATR对于人类和其他动物所造成的潜在的危害得到了广泛而持久的关注［1］，对于十足目甲壳动物也做了一些研究探讨［2－5］.

甲壳动物的生长蜕皮是一个复杂的激素调控过程，其中主要是由于眼柄中的X器官－窦腺复合体（X－organsinus gland complex，XO－SG）分泌的蜕皮抑制激素（molt inhibiting hormone，MIH）作用于Y器，调节Y器合成和分泌蜕皮激素（ecdyson），MIH和蜕皮激素间发生拮抗作用，共同调控甲壳动物的蜕皮过程［6］.

张志甫等［5］利用RT－PCR技术追踪检测了不同质量浓度的ATR对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）MIH表达的影响.本文在其基础上，采用ELISA技术分析研究不同质量浓度ATR暴露后，中华绒螯蟹血清中蜕皮激素含量的变化，初步阐明除草剂ATR对其蜕皮活动的影响，探讨ATR对中华绒螯蟹生长发育的毒性作用.

1 材料与方法

1.1 材料

实验用蟹于2010年3月、4月购自河北白洋淀，置于玻璃水族箱中暂养2周.选择健壮且附肢齐全的个体进行实验.蟹体质量为（12.07±0.51）g.

采用水体暴露方式对蟹进行ATR染毒处理.以二甲亚砜（DMSO）作为ATR的助溶剂，助溶剂终体积分数为0.01%［7］.设置0.001，0.01，0.1，1mg／L ATR处理组以及DMSO对照组，每组设置2个平行处理，每个处理20只蟹，雌雄各半.每2天换水1次，同时投入相应质量浓度的ATR，以保持整个处理过程中ATR质量浓度不变.

实验用水为经充分曝气、除氯的自来水（总硬度（以CaCO3计）230～240mg／L；pH 7.6～8.1），6L玻璃水族箱，暴露水体3L，自然水温（14～18℃），自然光照，处理周期30d，期间投喂混合饵料并及时清除残饵.

1.2 试剂及仪器

蟹蜕皮激素ELISA检测试剂盒（RD公司）.Model 680型酶标仪（BIO－RAD）；高速冷冻离心机.

1.3 方法

1.3.1 血清样品的获得

ATR处理30d后，取各处理质量浓度的中华绒螯蟹，体积分数为75%的乙醇溶液擦拭蟹体，剪断步足（或用1mL／0.45mm一次性注射器从第3步足基部抽取）收集血淋巴，4℃静置过夜.4℃，7 000r／min，离心15min.取上清液，分装，每份60μL，－80℃保存备用.

1.3.2 血清蜕皮激素含量测定

采用双抗体夹心ELISA测定血清中蜕皮激素含量.将已知蜕皮激素质量浓度的标准品和未知质量浓度的待测样品加入预先包被了蟹蜕皮激素抗体的酶标板反应孔内进行检测.37℃温育，洗涤后，加入HRP标记过的蜕皮激素抗体.再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A，B，产生颜色，颜色的深浅和样品中蜕皮激素的质量浓度呈正相关.经终止液终止反应，通过酶标仪检测OD值，根据标准品OD值和质量浓度做出标准曲线，即可得到待测样品蜕皮激素的含量.

1.4 数据处理

实验数据以平均值±标准误表示，采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，多重比较采用LSD法，Excel 2003作图.

2 结果与讨论

采用ELISA技术检测了不同质量浓度ATR暴露30d后中华绒螯蟹血清中蜕皮激素含量的变化，发现仅0.1mg／L ATR质量浓度组较助溶剂DMSO对照组有显著变化（图1）.

图1 莠去津对中华绒螯蟹血清中蜕皮激素含量的影响Fig.1 Effects of atrazine on serum ecdysone in Eriocheir sinensis

由图1可以看出，低质量浓度0.001，0.01mg／L ATR处理组以及高质量浓度1mg／L处理组暴露后，中华绒螯蟹血清中蜕皮激素含量和对照组的相比无显著变化，而中间质量浓度组0.1mg／L的蜕皮激素含量则显著低于对照组（P＜0.01）.这一结果与张志甫等［5］研究的ATR对中华绒螯蟹MIH的影响结果基本相反.ATR对中华绒螯蟹蜕皮激素含量的影响存在剂量上的倒“U”形曲线效应.

张志甫等［5］利用RT－PCR技术，研究ATR同样暴露30d后对中华绒螯蟹眼柄视上神经节中MIH表达量的影响.2个高质量浓度组（0.1mg／L和1mg／L）相比对照组均表现出了显著的差异性，但是表现形式并不相同：0.1mg／L极显著地提高了MIH的表达量，而1mg／L则对MIH的表达呈显著抑制效应.针对这一结果，同时为了进一步分析研究ATR对于中华绒螯蟹生长蜕皮的影响，本实验考察了ATR作用后血清中蜕皮激素含量的变化，发现低质量浓度和高质量浓度组均未表现出毒性效应，而中间质量浓度组0.1mg／L则使蜕皮激素含量显著降低，符合内分泌干扰物倒“U”形剂量效应规则.

内分泌干扰物的作用机制非常复杂，经典的毒理学规则“剂量决定毒性作用”有时并不适用于其毒性效应，而U形和倒U形剂量效应曲线在内分泌干扰物的毒性效应中是常见的表现形式［8－9］.所谓“U”形剂量效应，就是最大效应的出现发生于受试物的低质量浓度和高质量浓度暴露组，而非中间质量浓度组；倒“U”形剂量效应则相反，即中间质量浓度暴露组较低质量浓度和高质量浓度造成的影响要明显.当然，这也引发了不少争议，因为它毕竟与多年的对于毒物的毒性作用的认识不同.然而Gore等［10］指出，对于内分泌学来说这一现象不存在异议，因为这对于激素调控的内分泌系统来说是非常普遍的现象.

结合张志甫等［5］的研究结果和本实验的结果2部分内容来看，0.1mg／L ATR使MIH表达量升高的同时也降低了蜕皮激素的含量.蜕皮激素由Y器官合成分泌，而这一过程受到眼柄视上神经节XO－SG分泌的MIH调控，MIH通过降低胞内第二信使cAMP的水平抑制Y器合成蜕皮激素［6］，实验结果MIH表达量升高而蜕皮激素含量降低符合这一调控规律.

然而，1mg／L ATR对于中华绒螯蟹MIH（表达量显著降低）［5］和蜕皮激素（含量与对照组无显著差异）的影响值得思考，也就是说MIH的低表达并未触发Y器蜕皮激素的合成.笔者推测既然甲壳动物蜕皮的内分泌调控也是一个非常复杂的过程，其间涉及多种因素（如cAMP，Ca2＋，大颚器分泌的甲基法尼酯等）的共同调节［6］，那么ATR抑制MIH合成分泌的同时可能也影响到了其他因素在胞内或血淋巴中的水平，这些因素间的互相制约调节抵消了MIH低表达对蜕皮激素合成的启动作用，以至于未造成蜕皮激素的高表达.

内分泌干扰物对于甲壳动物生长蜕皮的影响方面已有很多研究，但作用机制并不相同.Zou等［11－12］发现外源雌激素可以显著地抑制大西洋砂招潮蟹（Uca pugilator）表皮中几丁质酶的活性，而该酶是蜕皮前期消化几丁质外壳所必需的.因此，极有可能是这些外源雌激素封闭了表皮上的蜕皮激素受体，从而抑制其几丁质酶的活性而影响了蜕皮作用的发生.

同雌激素一样，雄激素睾酮暴露也可以使大型溞Daphnia magna早期龄虫蜕皮受到抑制，但是龄虫体内蜕皮激素周期变化水平并未因为睾酮暴露而改变，而是睾酮可以拮抗20－羟基蜕皮激素的作用，证明睾酮同样是通过阻断蜕皮激素受体引发蜕皮抑制作用的［13］.然而，农业杀菌剂fenarimol存在不同的作用方式，它可直接造成蜕皮激素水平的降低而影响蜕皮［14］.

实验结果显示，ATR（0.1mg／L）对中华绒螯蟹生长蜕皮的影响，至少是因为ATR造成了眼柄视上神经节中MIH表达量的升高［5］，从而引起蜕皮激素合成分泌量的降低，使蜕皮作用受到抑制.推测ATR对于中华绒螯蟹蜕皮的影响还会有其他原因，但需进一步研究证实.

致谢：感谢穆淑梅老师在实验设计和论文写作过程中所做的贡献；感谢张志甫同学在实验材料染毒、养殖过程中所做的贡献.

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MU Shumei，KANG Xianjiang，ZHANG Zhifu，et al.Impacts of atrazine chronic poisoning on hemolymph DNA of Eriocheir sinensis［J］.Chinese Journal of Ecology，2010，29（6）：1240－1244.

［4］ 张晗，沈丹丹，穆淑梅，等.莠去津对雌性日本沼虾的毒性作用［J］.河北大学学报：自然科学版，2010，30（6）：701－705.

ZHANG Han，SHEN Dandan，MU Shumei，et al.Toxic effect of atrazine on female Macrobrachium nipponense［J］.Journal of Hebei University：Natural Science Edition，2010，30（6）：701－705.

［5］ 张志甫，穆淑梅，康现江，等.莠去津对中华绒螯蟹蜕皮抑制激素表达的影响［J］.水产科学，2011，30（4）：225－228.

ZHANG Zhifu，MU Shumei，KANG Xianjiang，et al.Effects of atrazine exposure on molt－inhibiting hormone expression in chinese mitten－handed crab，Eriocheir sinensis［J］.Fisheries science，2011，30（4）：225－228.

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［10］ GORE A C，HEINDEL J J，ZOELLER R T.Endocrine disruption for endocrinologists（and others）［J］.Endocrinology，2006，147（S）：1－3.

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［12］ ZOU E，FINGERMAN M.Effects of estrogenic agents on chitiobiase activity in the epidermis and hepatopancreas of the fiddler crab，Uca pugilator［J］.Ecotoxicol Environ Saf，1999，42：185－190.

［13］ MU X，LEBLANC G A.Developmental toxicity of testosterone in the crustacean Daphnia magnainvolves anti－ecydsteroidal activity［J］.Gen Comp Endocrinol，2002，129：127－133.

［14］ MU X，LEBLANC G A.Environmental antiecdysteroids alter embryo development in the crustacean Daphnia magna［J］.J Exp Zool，2002，293：287－292.

（责任编辑：赵藏赏）

Effects of atrazine on ecdyson secretion in Eriocheir sinensis

JlAO Manjing，CAO Jiapei，CHEN Qinna，LlU Beibei，KANG Xianjiang
（College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

In order to investigate the effects of atrazine on ecdyson secretion in Eriocheir sinensis，the crab was treated with 0.001，0.01，0.1，1mg／L of atrazine，and the mass concentration of ecdyson in the serum was measured by ELISA.The result showed that at relatively lower and higher doses（0.001，0.01，1mg／L），atrazine did not show any significant differences with the control groups；but at the middle concentration（0.1mg／L），the herbicide could significantly decrease ecdyson level in serum of the crab.That maybe affects the molt of E.sinensis.

atrazine；Eriocheir sinensis；ecdyson

X 503.225；Q 959.223

A

1000－1565（2013）02－0181－04

10.3969／j.issn.1000－1565.2013.02.013

2012－09－10

国家自然科学基金资助项目（31202000，31272309）；河北省自然科学基金资助项目（C2011201028）；河北大学博

士基金资助项目（2012－239）；保定市科学技术研究与发展计划项目（10ZN008）

焦满静（1986－），女，河北涿州人，河北大学在读硕士研究生.

康现江（1964－），男，河北邯郸人，河北大学教授，博士生导师，主要从事细胞发育分化及其调控方面的研究.

E－mail：xjkang＠hbu.edu.cn