糖尿病大鼠体外循环术后认知功能变化及海马NF-κBp65蛋白的表达

尹光明梁卫东郑德玉

（1 济宁医学院附属医院，山东 济宁 272029；2 山东省五莲县人民医院，山东 济宁 272029）

糖尿病大鼠体外循环术后认知功能变化及海马NF-κBp65蛋白的表达

尹光明1梁卫东1郑德玉2

（1 济宁医学院附属医院，山东 济宁 272029；2 山东省五莲县人民医院，山东 济宁 272029）

目的 探讨糖尿病大鼠体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）术后认知功能的变化。方法 将 SD 大鼠随机分成非糖尿病 CPB 组（A 组）及糖尿病 CPB 组（B 组）。腹腔一次性注射 1%STZ （溶于 pH 4.2，0.1%mol/L 柠檬酸 -柠檬酸钠缓冲液）60mg/kg 建立糖尿病模型，糖尿病模型建立后第 7 周建立 CPB 模型。观察糖尿病大鼠 CPB 后认知功能的变化以及海马 NF-κBp65 蛋白的表达，抽取静脉血用 ELISA 法检测 TNF-α 及 IL-10 含量。结果 各组大鼠术前认知功能测试无显著性差异（P＞ 0.05），体外循环后 5 天各组差异显著，糖尿病 CPB 组（B 组）电击次数明显增加（P ＜ 0.05，P＜ 0.01），差别有显著性。B 组大鼠脑组织海马 NF-κBp65 蛋白阳性细胞数明显增多，差异有统计学意义（P ＜ 0.01）。两组大鼠血清 TNF-α 及 IL-10 含量均有增高，B 组大鼠增高更加明显，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。结论 糖尿病可以引发并加重体外循环后大鼠脑内 NF-κBp65 蛋白过度表达，促使细胞因子释放，对脑组织产生损伤并出现认知功能障碍。糖尿病通过 NF-κBp65 蛋白途径参与糖尿病体外循环术后认知功能障碍的发生发展。

糖尿病；NF-κBp65 蛋白；认知功能障碍；体外循环；发病机制

自从1953年体外循环应用于临床以来，体外循环下心脏手术后的脑部并发症的发生逐年增多。神经认知功能障碍是CPB后最为常见的神经系统并发症，成为术后主要并发症之一，可导致术后康复延迟、住院时间和医疗费用增加及生活质量的下降。糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病，随着生活方式的改变和老龄化进程的加速，其患病率呈快速上升趋势。

近年来患有糖尿病患者心脏手术逐年增加，有许多临床研究证明糖尿病患者体外循环心脏手术后的脑损伤的发生率远远高于非糖尿病患者[1]。现认为糖尿病是导致认知功能障碍的危险因素之一，但引起并加重体外循环后认知障碍发生的具体作用机制仍不清楚。目前，尚没有采用动物试验研究糖尿病体外循环后脑认知功能障碍的报道。本研究通过观察糖尿病大鼠体外循环后脑核转录因子NF-κBp65蛋白的表达及认知功能的变化，以探讨糖尿病在体外循环后导致认知障碍的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及动物分组：健康成年雄性清洁级SD(Sprague-Dawley)大鼠20只，体质量为400～450g，鼠龄16～22周，室温温度19～24℃，相对湿度60%～70%，常规普通饲料饲养，保持室内通风，每天维持光照8～12h。20只大鼠随机分为正常对照组（A组）及糖尿病组（B组）。在糖尿病动物模型建立后第七周，两组同时建立体外循环模型。在建立糖尿病模型及CPB模型中动物死亡视为模型复制失败，不计在内，用同一批次的大鼠制成合格模型后补充。

1.2 动物模型制作

1.2.1 糖尿病动物模型

20只雄性SD大鼠适应性喂养1周后建立链脲佐菌素（STZ，美国Sigma）糖尿病模型。大鼠禁食水10h，随机抽取10只腹腔一次性注射1%STZ （溶于pH4.2，0.1%mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液）60mg/kg，其余10只大鼠注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（对照组，A组）。血糖稳定3d后，尾静脉随机血糖＞16.7mmol/L认为糖尿病模型建立成功（糖尿病组，B组）。造模成功后进入下一步试验。

1.2.2 CPB动物模型

大鼠糖尿病模型制模成功后第7周，两组大鼠均建立CPB模型。利用大鼠专用膜式氧合器，经右颈脉插管引流，尾动脉插管灌注，建立CPB。CPB采用无血预充共20ml，由乳酸林格氏液12mL、6%羟乙基淀粉7mL及甘露醇1mL组成。测ACT时间＞480s时开始CPB。转流开始灌注量约为20～40mL/（kg·min），逐渐增加达全流量160～180 mL/（kg·min），平均维持在100～120 mL/（kg·min），保持平均动脉压8.0～13.3kPa。根据麻醉深度适当补充咪唑安定。转流60min后停机，严密监测生命体征，必要时给予盐酸多巴胺注射液3～10μg/（kg·min） ，并根据CVP经尾动脉使用微量泵精确回输机器残留血或胶体液。采用改良的Brain同轴回路给予机械辅助呼吸，呼吸机条件根据血气结果调整。当大鼠血流动力学稳定后拔除测压装置，自主呼吸平稳后停止机械通气，拔除气管导管。把大鼠放入观察箱，给氧，保温，自由进水及食物，观察5d。

表1 两组各时间点血糖值比较（χ—±s，mmol/L）

1.3 行为学检测

应用MG-2型电迷宫进行行为学测试[5]，以试验对象被电击后从电击区一次性逃至安全区为“正确”，连续训练，记录试验对象达到学会（连续10次测试中9次正确确定为“学会”）标准所需的电击次数，作为判断测试对象学习记忆的指标。行为学测试分别于糖尿病模型建立前、CPB模型建立前一周即糖尿病模型建立后第6周及CPB后5d进行，于当天上午进行。

1.4 血糖检测

在糖尿病模型建立前（T1）、糖尿病模型建立后第5周（T2）、CPB模型建立前（T3）、CPB结束（T4）、CPB后3d（T5）及CPB术后5d（T6）不同时间点从大鼠尾静脉采血测血糖。

1.5 NF-κBp65蛋白表达

采用免疫组化法检测NF-κBp65蛋白表达，阳性细胞为胞体内出现棕黄色颗粒，以胞浆出现为主，强阳性时细胞核也出现棕黄色颗粒。在200倍光镜下观察海马CA3区，选取十个视野，计数阳性神经元数，以均值代表该切片的阳性神经元数。

1.6 统计学处理

所有数据均采用Spss11.5软件进行统计处理，组间比较用方差分析，两两比较用t检验。P＜0.05时有统计学意义。相关分析采用Pearson相关分析。

2 结 果

2.1 两组不同时间点血糖值比较

对照组（A组）血糖较糖尿病组（B组）低（P＜0.05），差异有统计学意义。随着时间延长，各组血糖值轻度升高，同组比较P＞0.05，无统计学意义（表1）。

2.2 行为学检测

两组大鼠在糖尿病模型及CPB模型建立前测试无显著性差异（P＞0.05）；CPB后5d测试两组差异显著，糖尿病模型组模型组电击次数明显增加（P＜0.01）。见表2。

表2 两组大鼠不同时间点行为学检测结果（电击次数，χ—±s）

2.3 脑组织NF-κBp65蛋白表达

对照组大鼠在CPB模型建立前未见脑组织NF-κBp65蛋白表达，糖尿病组在CPB模型建立前已有NF-κBp65蛋白表达的阳性细胞，主要染色在细胞浆，无明显核染色。至CPB结束后5d，对照组才出现NF-κBp65蛋白表达的阳性细胞，而糖尿病组大鼠脑组织海马NF-κBp65蛋白阳性细胞数明显增多，且已有明显细胞核着色，结果具有显著性意义（P＜0.05）。NF-κBp65蛋白阳性细胞计数见表3。

表3 两组大鼠不同时间点海马NF-κBp65蛋白阳性细胞数比较（χ—±s）

2.4 相关性分析

NF-κB表达与认知功能障碍有明显正相关关系（r=0.69，P＜0.05），海马NF-κB表达越多，发生认知功能障碍的概率增加。

3 讨 论

CPB自从上世纪50年代引入临床，已经广泛应用于外科手术中。尽管CPB材料不断更新，技术不断进步，但是其本身仍然是心脏手术术后并发症的主要原因[2]。神经认知功能障碍是CPB术后最为常见的神经系统并发症。CPB后并发症一般与微栓子、低灌注和炎症反应有关，而相应的危险因素则包括：高龄、高血压、心脑血管疾病及糖尿病等。随着糖尿病的发病率逐年增多，糖尿病成为越来越突出的危险因素。

糖尿病是认知功能障碍的危险因素[3]，并且使患者体外循环术后认知功能障碍加重，预后差，但糖尿病引起并加重患者体外循环后认知功能障碍的机制仍不完全清楚。

糖尿病患者全身和局部炎性反应增强，其产生的分子基础与NF-κB的异常表达有关。有研究显示，无论糖尿病病程长短，患者体内多种组织均有NF-κB的异常表达[4-10]。体外循环时血液直接与人工心肺机的异物表面接触、手术创伤、组织器官的缺血再灌注损伤等均可诱发补体、凝血因子等瀑布样激活，粘附分子表达，并使单核巨噬细胞及中性粒细胞释放细胞因子，导致全身炎性反应，炎性反应在术后的组织损伤及器官功能失调中起重要作用。CPB心脏直视手术所致脑损伤主要与CPB期间大脑组织缺血缺氧有关。CPB后脑损伤可表现为术后认知障碍，神经功能评分下降[11,12]。很多研究提示体外循环后机体内均有NF-κB激活[13]。

在炎症反应的复杂细胞因子网络中，NF-κB可调节多种促炎因子的表达，是炎症级联反应的最重要的调控因子之一，被认为是炎症反应的中心环节。NF-κB能启动与免疫和炎症有关的基因，这些基因的转录，在炎症和自身免疫反应中起重要作用[14]。炎症因子作为新的NF-κB激活剂，进一步使NF-κB持续活化又诱导相应基因持续转录，引起炎症反应的放大及恶性循环[15,16]，加重组织器官的再灌注损伤。

本研究发现，糖尿病模型建立第6周，海马有NF-κB蛋白的表达，而对照组在相同时间点NF-κB蛋白表达，提示高血糖可激活NF-κB，使NF-κB的活性增强。体外循环后两组大鼠NF-κB蛋白表达明显增多，但糖尿病组大鼠NF-κB蛋白表达更明显，提示CPB进一步激活脑组织NF-κB蛋白表达，从而加重放大了一系列炎症反应，进一步加重脑组织损伤。

在本研究中，认知功能障的发生与NF-κB表达呈正相关，证实了NF-κB在认知功能障碍中起作用，从而提示了核因子NF-κB表达增强，可加重糖尿病体外循环后脑功能损伤，产生认知功能障碍。

本研究显示糖尿病可使脑组织NF-κB的激活，NF-κB可调节多种促炎因子的表达，是炎症反应的中心靶点，是炎症级联反应中最重要的调控因子，因此认为糖尿病加重体外循环后认知功能障碍可能与激活NF-κB有关。NF-κB激活是糖尿病加重体外循环术后认知功能障碍的重要机制之一。

综上所述，高血糖可以引发脑内NF-κB活化，CPB进一步加重脑内NF-κB活化，并产生认知功能障碍。NF-κB活化作为重要的始动及促进因子参与了糖尿病体外循环后认知功能障碍的发生发展。因此，对NF-κB活化与认知功能障碍关系的深入研究，有可能找到一条新的有效的干预糖尿病体外循环后认知功能障碍的发生发展途径。

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Influence of α-lipoicacid to Cognition Function Impairment and NF-κBp65 Expression of Hippocampus after Cardiopulmonary Bypass in Diabetic rats

YIN Guang-ming1, LIANG Wei-dong1, ZHENG De-yu2
(1 The Affiliated Hospital of Jining Medical University ,Jining 272029, China;2 Wulian People's Hospital, Jining 272029, China)

ObjectiveDiabetic rats cardiopulmonary bypass (cardiopulmonary bypass, CPB) changes in postoperative cognitive function..MethodsSD rats were randomly divided into non-diabetic CPB group (A) and diabetes CPB group (B). Intraperitoneal single injection of 1% STZ (dissolved in pH 4.2, 0.1% mol/L citric acid - sodium citrate buffer) 60mg/kg create a model of diabetes, diabetic model after 7 weeks in CPB model. Of diabetic rats after CPB cognitive function changes, and the hippocampus the NF-κBp65 protein expression to extract the venous blood ELISA was used to detect TNF-α and IL-10 levels.ResultsTests of cognitive function in rats preoperative significant difference (P＞0.05), five days after cardiopulmonary bypass groups significantly different, diabetes CPB group (B) the number of shocks increased significantly (P＜0.05, P＜0.01), the difference is significant. Group B rat brain hippocampus the NF-κBp65 protein-positive cells increased significantly, and the difference was statistically significant (P＜ 0.01). The two groups of serum TNF-α and IL-10 levels have increased more significantly increased B rats, the difference was statistically significant (P＜0.05).ConclusionsDiabetes can trigger and aggravate cardiopulmonary bypass the rat brain of NF-κBp65 protein overexpression, prompting the release of cytokines, brain tissue damage and cognitive dysfunction. Diabetes through NF-κBp65 protein pathways involved in the development of diabetes the extracorporeal circulation postoperative cognitive dysfunction.

Diabetes; NF-κBp65 protein; Cognitive dysfunction; Cardiopulmonary bypass; Pathogenesis

R587.1

：B

：1671-8194（2013）04-0055-03