紫外辐照联合多聚甲醛熏蒸法制备真菌扫描电镜样品的初探

钱闻博，张天一，沈永年，朱昌来

（1南通大学医学院；2南通大学神经再生重点实验室，江苏226001；3中国协和医科大学皮肤病研究所，南京210042）

真菌是生物界中很大的一个类群，常以孢子或菌丝的方式进行繁殖。真菌孢子的形态学特征，以及在菌丝上的排列方式是鉴别真菌种属的重要指标之一。部分真菌能引起人类或其它动植物致病，称为病原性真菌。目前对真菌性疾病病原体的诊断和鉴定，主要方法是通过菌株培养后光学显微镜检查，即通过形态学结合菌落形态和生理学的方式[1]。另一种是通过聚合酶链反应、聚合酶链反应-RFLP等分子生物学的方式来进行[2-4]，但形态学鉴定仍是病原真菌鉴定的金标准。因常规的生物样品扫描电镜标本处理方式固定、逐级脱水会导致孢子脱落及变形，且时间较长。故直接通过扫描电镜来观察病原性真菌，以及在显微镜下观察菌丝、孢子结构、形态来鉴定病原真菌的报道尚少。本研究采用一套简单快速的扫描电镜真菌样品制备方法，能方便、完整和快速的观察真菌的菌丝及孢子的形态及孢子的芽生方式。为进行菌株相应的病原学归类、发病机制探讨和抗菌药物的筛选提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 (1)菌株：棘状外瓶霉（CMCC(F)D.22f）、皮炎外瓶霉（CMCC(F)D.9g）、麦轴霉（CMCC(F)B.73）、申克孢子丝菌（CMCC(F)D.1a）各 1株。均由中国医学科学院皮肤病研究所、卫生部医学微生物菌（毒）种保藏中心真菌中心提供。（2）培养基：葡萄糖马铃薯琼脂（PDA）、葡萄糖2g、20%马铃薯浸液100mL、琼脂 1.5g，121℃、20min 高压灭菌后，冷却至45～55℃，取约20mL，倒入9cm培养平皿。待培养基凝固后用灭菌手术刀切成1cm×1cm的小方块置4℃备用。（3）仪器：自动金属镀膜仪（JFC-1600，Jeol）；扫描电子显微镜（Hitachi,S-3400N）。

1.2 方法 将实验菌株接种至已备好的小方块培养基上，通过玻片小培养法进行自然生长下的微型培养。27℃培养2周后获得完整的显微结构后，用紫外辐射30min后放置于封闭盒内。用甲醛蒸汽熏蒸过夜处理，去除原培养片上得培养基，仅保留菌落匍匐在玻片上的原始生长状态和结构形态。随后直接进行金属镀膜处理，并于扫描电镜下观察真菌菌丝及孢子的表面形态。扫描电镜观察时的加速电压为15.0kV，真空度为高真空模式。

2 结 果

扫描电镜下清晰可见大量的不同形貌的真菌繁殖分裂孢子和菌丝等结构的形貌，菌丝的形态与常规方法无明显差异。不同种类真菌孢子形态呈现不同形态，如呈长卵圆形、球形等，且大小也不一。部分真菌孢子数目众多，呈葡萄串状或花瓣状（见图1）。在样品处理过程中，因未经过多步骤的液体环境，孢子数量基本不曾丢失。

图1 几种真菌孢子的扫描电镜观察

3 讨 论

目前直接通过扫描电镜来观察病原真菌菌丝和孢子结构形态来鉴定菌群的研究尚少，主要原因是样品处理复杂、制备时间较长。另外是通过常规的标本处理会导致孢子大量脱落、丢失。虽林柏青等[5]报道通过液氮冷冻制备的方式处理样品并通过扫描电镜观察真菌孢子样品，但其样品仍通过传统的固定液固定、缓冲液洗涤、脱水剂脱水等步骤。其结果是不可避免的造成一些成熟孢子的脱落、丢失，从而在镜下不能真正获得真菌孢子最原始的表面形貌结构特征。

本文介绍的方法首先将样品进行紫外线辐照30min，以对菌株进行初步的消毒灭菌处理，防止造成交叉感染及环境污染。紫外辐照后继续进行甲醛的熏蒸处理，不仅具有消毒的作用，更主要是达到固定目的。通过本方法处理的真菌样品，其菌丝、孢子梗及孢子不仅没有产生脱落、皱缩塌陷现象，且其表面的微细形貌结构保存完好。在15KV的加速电压下仍相当清晰，而无明显的荷电效应。其原因与真菌结构有关，真菌细胞外层有较厚的细胞壁结构，而成熟的细胞壁由几丁质层、蛋白质层、葡萄糖蛋白层及质层葡萄糖层组成，一定程度上抵消了在张力变化对样品表面的影响。因此，能经受住样品在低真空环境下，喷镀及电镜下观察无明显的变形。但本方法对部分含水量很高、孢子壁很薄的真菌或真菌生长早期的使用应加以注意，因真菌生长早期的细胞壁结构仅有两种结构，即几丁质层及蛋白质层[6]。这使其在真空喷镀及在进行扫描电镜观察时，会造成一定的皱缩及发生较严重的荷电现象。为避免此种现象，应采取低真空及低电压模式观察。

本实验通过简单的标本处理方式，可快速进行扫描电镜观察。从而能较快捷、方便、完整的观察不同类型真菌，如临床上引起深部感染的丝状真菌孢子的大小、形态、芽生方式等。通过真菌结构形态鉴定来进行相应的病原学归类，为指导临床用药提供一定的参考依据。

[1]刘军，沈永年，吕桂霞,等.菌落PCR技术快速鉴别丝状真菌的实验研究[J].中华皮肤科杂志，2006，39(8）:439-440.

[2]Agrawal V，Roy N.Contaminating insert degradation by preincubation colony PCR：a method for avoiding false positives in transformant[J].Anal Biochem，2008，375(1)：159-161.

[3]张晓利，吕雪莲，沈永年,等.菌落PCR技术快速鉴别丝状真菌的实验研究[J].中华皮肤科杂志，2011,44（8）:556-559.

[4]Mirhendi H,Makimura K,Khoramizadeh M,et al.A one-enzyme PCR-RFLP assay for identification of six medically important Candida species[J].Nippon Ishinkin Gakkai Zassh，2006，47(3)：225-229.

[5]林柏青，林均安.真菌样品简易冷冻制备方法[J].云南农业大学学报,1991,6（3）：175-176.

[6]Griffin DW，Kellogg CA，Peak KK，et a1.A rapidand efficient assay for extracting DN Afrom fungi[J].Lett Appl Microbiol，2002，34(3)：210-214.