斑蝥酸钠维生素B6对人肝星状细胞增殖的影响及其机制

牛丽娟，李 涛，贺丽珠，关丽云，田金飞，马国刚

(1石家庄市第三医院，石家庄050017;2河北医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室)

斑蝥素是一种半帖烯毒素，斑蝥酸钠是斑蝥素与氢氧化钠共热时水解生成的一种半合成药物，其毒性和刺激性都比斑蝥素低［1］。斑蝥酸钠维生素B6注射液是由斑蝥酸钠和维生素B6配制而成的合成药物。研究显示，该药物对多种肿瘤(如肝癌、胃癌等)和肝纤维化都有良好的疗效［2～4］，但尚未见其对肝星状细胞影响的报道。肝星状细胞的活化是肝纤维化形成的中心环节，如何减少肝星状细胞的活化和增殖已成为抗肝脏纤维化研究的热点。2012年5月～2013年1月，我们就斑蝥酸钠维生素B6对人的肝星状细胞LX-2增殖的影响以及相关基因的表达变化进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料 斑蝥酸钠维生素B6注射液购自贵州柏强制药有限公司;胎牛血清及高糖DMEM培养基购自美国Hyclone公司;胰酶、MTT、RNA提取试剂盒Trizol购自上海生工公司;RT-qPCR扩增系统购自美国Promega公司;PCR引物采用Primer5.0自行设计并由华大基因公司合成;人肝星状细胞LX-2购自中南大学湘雅医学院细胞中心。主要仪器有超净工作台、CO2培养箱、Rotor-Gene6000荧光定量PCR仪等。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肝星状细胞LX-2用含12%胎牛血清的高糖DMEM培养基在37℃、5%CO2条件下孵育培养，0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 细胞增殖检测 采用MTT法，将对数生长期LX-2细胞以每孔6×104个接种于96孔板，在37℃、5%CO2条件下孵育，24 h后换无血清DMEM培养液37℃再孵育24 h，使细胞基本同步化G0期后再分1、5、10μg/mL斑蝥酸钠维生素B63个观察组和1个空白对照组。培养24、48、72 h后，在每孔加入20μL MTT溶液(5 mg/mL)继续培养4 h，终止培养。吸去培养液，然后每孔加入150μL二甲基亚砜，振荡15 min，使结晶充分溶解。同时设置调零孔，在酶联免疫检测仪波长490 nm处测量各个孔的吸光度(OD)值。细胞生长抑制率(%)=(1－观察组OD值/空白对照组OD值)×100%。

1.2.3 Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、转化生长因子 β1(TGF-β1)基因mRNA表达检测 采用RT-qPCR方法，用10μg/mL斑蝥酸钠维生素B6作用细胞72 h后，按RNA提取试剂盒要求提取细胞RNA，取1μg总RNA，按反转录试剂盒要求进行反转录成cDNA。将cDNA按以下反应体系:1μL cDNA、1μL上游引物、1μL下游引物、10μL预混的PCR反应缓冲液，7μL双蒸水在荧光定量PCR仪上进行扩增。循环条件为94℃ 5 min，94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s共35个循环。引物序列为内参GAPDH，上游引物5'-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3'、下游引物 5'-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3'。TGF-β1上游引物5'-ACAGCAACAATTCCTGGCGATAC-3'、下游引物5'-GCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT-3'。Ⅰ型胶原上游引物5'-CCCAGCCACAAAGAGTCTACAT-3'、下游引物5'-TCATGGTACCTGAGGCCGTT-3'。Ⅲ型胶原上游引物 5'-CGCCCTCCTAATGGTCAAGG-3'、下游引物5'-TTCTGAGGACCAGTAGGGCA-3'。扩增产物均跨越内含子，以防止基因组DNA的扩增。荧光定量PCR中每个样本重复3次，取平均值为Ct值(为热循环仪中荧光达到荧光阈值的循环数)，采用相对定量2－ΔΔCt法比较目的基因表达变化。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时间LX-2细胞抑制率 斑蝥酸钠维生素B6注射液对LX-2细胞的增殖抑制作用随作用时间的延长和药物浓度的增加而增强。见表1。

表1 各组不同时间LX-2细胞抑制率比较(%，¯x±s)

2.2 10μg/mL组72 h后Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1mRNA表达 见表2。

表2 10μg/mL组72 h后Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1 mRNA表达(¯x±s)

3 讨论

慢性肝病是严重危害人类健康的一类疾病，而肝纤维化是慢性肝病发展过程中一个共同的病理改变。肝纤维化是指各种病因所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。肝星状细胞的活化增殖、TGF-β1水平变化在肝纤维化形成过程中起极其重要的作用，多种细胞均可合成分泌TGF-β1，尤其是肝星状细胞。TGF-β1又可通过自分泌和旁分泌方式反作用于肝星状细胞表面的 TGF-β1受体，通过 TGF-β1通路刺激Ⅰ、Ⅲ型胶原大量合成、分泌，造成肝纤维化的形成［5］。因此，抗纤维化治疗的目的就是要抑制星状细胞的活化和增殖，进而抑制细胞外基质的产量，因此诱导活化的肝星状细胞凋亡是抗肝纤维化的一种有效途径。

斑蝥酸钠具有抗肿瘤、抗炎、调节免疫、升高白细胞、抗组织纤维化的作用。已有研究证实，斑蝥酸钠对肾脏纤维化有治疗作用［4］，但其对肝纤维化的作用尚未见报道。本研究应用MTT法检测斑蝥酸钠对LX-2增殖的影响，将不同浓度的斑蝥酸钠分别作用于LX-2细胞24、48、72 h后，显示斑蝥酸钠对LX-2的增殖有抑制作用，其抑制作用具有一定的时间剂量关系。与国内外文献报道相对细胞生长影响结果相一致［6、7］。TGF-β1是肝星状细胞自分泌扩增的重要细胞因子，既增加胶原的合成，又进一步刺激TGF-β1的产生，使更多静止的肝星状细胞被激活。TGF-β1信号通路在肝纤维化的发生发展过程中的作用已经被很多研究所证实［8、9］。我们采用荧光定量PCR的方法从mRNA水平检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1基因表达变化，发现斑蝥酸钠可以抑制TGF-β1的产生，阻断自分泌放大过程，从而减少Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成。故斑蝥酸钠可能通过TGF-β1信号通路抑制肝星状细胞的活化和增殖，减轻肝纤维化。

综上所述，斑蝥酸钠能抑制人肝星状细胞LX-2的活化和增殖，其机制可能与其干扰TGF-β1信号通路有关。其具体的分子机制还需进一步研究。

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