空瓶刺激心理应激法建立大鼠血管内皮损伤模型的评价
2013-06-14杨晓梅
梁 斌,黎 静,杨晓梅,谢 露
(广西医科大学生理学教研室,南宁530021)
血管内皮细胞(VEC)在维持血管正常功能方面发挥重要作用,它不仅是血液与组织液之间的屏障,而且可分泌多种活性物质来调节血管壁张力以及血管平滑肌的增殖,如内皮素-1(ET-1)可以使血管强烈收缩及促进细胞分裂,前列环素(PGI2)和一氧化氮(NO)使血管舒张等[1]。VEC受损或功能障碍是血管疾病发病机制中的一个重要因素,与心血管疾病临床危险事件的发生密切相关[2]。在VEC损伤因素中,除高血压、高血糖、高同型半胱氨酸、血脂紊乱、炎症刺激外,心理应激也是一个不容忽视的危险因素。各式各样的心理应激刺激,如与情绪有关的焦虑、抑郁,与环境有关的空气污染、噪声,与行为有关的工作、生活压力等,都可构成各自独立的心血管系统危险因素[3]。心理应激时交感神经活动增强,机体释放肾上腺素(Adr)、皮质醇(COR)、ET、血栓素B2(TXB2)及Adr的代谢产物如过氧化氢(H2O2)、甲醛(FA)、甲胺(MA)等物质增多,或引起血管舒缩因子失调,或直接损害VEC,进而引起血管病变[4]。本课题组前期研究发现,愤怒心理刺激模型可以损伤VEC,改变其形态并影响其功能。2011年5月1~22日,我们拟制作空瓶刺激心理应激模型大鼠,通过观察其行为学改变,检测应激激素及其代谢产物、VEC活性物及其超微结构,并进行评价,为心理应激与VEC损伤关系的研究提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料 实验动物:健康成年雄性SD大鼠,10~15周龄,体质量200~250 g,由广西医科大学实验动物中心提供,实验动物合格证号为 SCXK桂2009-0002。实验设备:台式低速离心机(湘仪离心机仪器有限公司),iMARK型全自动酶标仪(美国Bio Rad公司),紫外光—可见光分光光度计(上海精密科学仪器公司),自动恒温水浴箱(南京环科试验设备有限公司),-80℃低温冰箱(日本三洋),H-7650透射式电子显微镜(日本日立公司产品),自制旷场箱,LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津产品),SUPEL COSILTM LC-PAH色谱分离柱(日本岛津产品),超纯水机(Mllipoer),旋涡混匀器(德国IKA),进样针(Hmailton)。试剂:Adr试剂盒(武汉华美生物公司),ET试剂盒(北方放射免疫生物技术公司),6-酮-前列环素 F1α(6-Keto-PGF1α)试剂盒(北方放射免疫生物技术公司),TXB2试剂盒(北方放射免疫生物技术公司);COR试剂盒(北方生物技术研究所),NO试剂盒(cayman chemical company),过氧化氢(H2O2)检测试剂盒(南京建成生物有限公司产品);氨苄西林(Sigma产品);分析纯三氯乙酸(TCA);MA(Sigma产品),丹磺酰氯(Sigma产品),37%FA水溶液(Sigma产品),乙腈(美国Tedia产品),甲醇(美国天地产品),Milli2Q超纯水,生理盐水(湖南金健药业有限责任公司)。
1.2 方法
1.2.1 分组与造模 将16只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组各8只,两组第1周每天早晚9点定时喂水10 min;第8~21天,对照组(群居饲养)早晚9点依然定时饮水10 min,模型组(孤独饲养)早晚9点按随机表给予空瓶刺激或喂水10 min,两组均按体质量腹腔注射生理盐水(200 g/mL)2次/d。
1.2.2 大鼠行为学观察 采用自制旷场箱观察大鼠行为学变化。旷场箱为高50 cm,长、宽均为100 cm;其周壁、底面为黑色,底面用黄线划分为面积相等的25格(20 cm ×20 cm)。将大鼠置于旷场箱底面的中心方格内并开始计时,采用单盲法观察并记录大鼠在3 min内的行为。动物穿越底面的格数(四爪均进入的方格)记录为水平活动得分,跨越一格计1分;后肢直立次数(两个前爪腾空或攀附箱壁)为垂直活动得分,直立1次计1分。水平得分与垂直得分之和为总分。
1.2.3 血浆相关因子检测 取各组大鼠血浆,用ELISA法检测 Adr,放射免疫法检测 ET、6-Keto-PGF1α、TXB2、COR,硝酸还原酶法检测 NO,化学比色法检测H2O2,高效液相色谱法测MA、FA。
1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。结果以±s表示,组间差异比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组大鼠旷场实验评分比较 模型组垂直得分(11.33 ±4.97)分、水平得分(57.43 ±7.64)分、总分(68.77±10.94)分,对照分别为(5.83±1.47)、(42.50 ±8.41)、(48.33 ± 9.58)分;两组比较,P 均 <0.05。
2.2 两组大鼠血浆COR、Adr水平比较 见表1。
表1 两组大鼠血浆COR、Adr比较(n=8±s)
表1 两组大鼠血浆COR、Adr比较(n=8±s)
注:与对照组比较,*P <0.05
组别 COR(ng/mL) Adr(pg/mL)模型组 21.47 ±3.65* 9.37 ±1.69*对照组14.67 ±2.98 2.73 ±1.34
2.3 两组大鼠血浆6-Keto-PGF1α、TXB2水平比较见表2。
表2 两组大鼠血浆6-Keto-PGF1α、TXB2水平比较(n=8,± s)
表2 两组大鼠血浆6-Keto-PGF1α、TXB2水平比较(n=8,± s)
注:与对照组比较,*P <0.05
组别6-Keto-PGF1α(pg/mL)TXB2(pg/mL)6-Keto-PGF1α/TXB2模型组 53.19 ±11.23* 515.07 ±68.66 0.10 ±0.02*对照组95.41 ±30.38 472.61 ±48.73 0.19 ±0.07
2.4 两组大鼠血浆NO、ET水平比较 见表3。
表3 两组大鼠血浆NO、ET水平比较(n=8¯±s)
表3 两组大鼠血浆NO、ET水平比较(n=8¯±s)
注:与对照组比较,*P <0.05
组别 NO(mmol/mL) ET(pg/mL)NO/ET模型组 19.13 ±2.95* 28.89 ±2.53* 0.66 ±0.09*对照组25.00 ±4.04 24.73 ±6.35 1.02 ±0.18
2.5 两组大鼠血浆 MA、FA、H2O2水平比较 见表4。
表4 两组大鼠血浆MA、FA、H 2O2水平比较(n=8,±s)
表4 两组大鼠血浆MA、FA、H 2O2水平比较(n=8,±s)
注:与对照组比较,*P <0.05
组别 MA(ng/mL) FA(ng/mL) H2O2(mmol/L)模型组 37.35 ±10.14* 7.34 ±2.37* 57.20 ±10.28*对照组22.78 ± 4.24 4.72 ±1.20 23.92 ± 8.04
2.6 两组大鼠主动脉VEC透射电镜结果比较 对照组VEC线粒体结构完整,嵴清晰、排列紧密;模型组VEC线粒体肿胀、内有空泡,嵴结构疏松。见图1。
图1 两组大鼠主动脉VEC透射电镜结果(×5 000)
3 讨论
应激是指施加于个体的、引起个体发生反应的躯体或心理的压力,是个体在觉察需求与满足需求的能力不平衡时倾向于通过整体心理和生理反应表现出来的多因素作用的适应过程[5]。心理应激作为应激的一个重要部分,它与疾病之间亦有着紧密联系,无论是急性或慢性心理应激都显著影响疾病的发生、发展及预后,如肿瘤、高血压、中风等[6]。因此,成功构建一个心理应激动物模型,用以研究人们对应激概念的认识及对应激相关性疾病的研究尤为重要。
应激的反应主要有情绪反应、行为反应、认知反应和心理防御反应等。焦虑、愤怒、恐惧及抑郁是应激环境下的主要情绪反应,由于应激源、情境因素和机体特点的不同而不同。应激下的行为反应与情绪反应一样,因应激源及环境因素等的不同而不同。攻击是个体受到挫折之后常见的反应[7]。旷场实验是研究大鼠在新环境中的探究行为及情绪的经典方法,可有效评价动物对新异环境的兴奋性、适应性、探究、紧张、记忆等多种行为[8],可用来测试动物中枢神经系统的兴奋或抑郁状态[9]。实验中,动物的水平得分反映动物的兴奋性,垂直得分则主要反映动物对周围环境的不确定性和探究趋势[8]。本实验结果显示,模型组大鼠的水平得分和垂直得分均明显高于对照组,表明空瓶刺激后大鼠兴奋性、敏感性增强,探究活动增多,此结果与其他报道相似[10],且给予空瓶情绪刺激的模型组出现了在陌生环境中的自主活动和探究行为增多的表现,说明在应激后大鼠产生了情绪应激反应。
急性或长期慢性心理刺激可以损伤VEC,这是导致心脑血管疾病的一个重要因素[11]。应激反应由于常反复启动内皮损伤,引起血管舒缩因子分泌失衡,可最终导致心血管的病变[4]。VEC释放血管舒张因子NO、PGI2,血管收缩因子ET-1、TXA2等调节血管的舒缩功能,从而维持基础张力的稳定[6]。Wallace等[12]研究证实,VEC损伤后,ET合成增多、NO合成和释放减少,导致血管张力调节紊乱,内皮依赖性舒张功能下降,血管壁结构改变,进而引起血压升高。VEC合成的另一对调节血管张力的细胞因子是TXA2和PGI2,TXA2和PGI2是作用相反的两种前列腺素。TXA2由血小板释放,可使血小板的聚集加重,及引起血管收缩;PGI2则相反,可防止血小板聚集及血管收缩,是一种血管扩张剂[6]。二者在血液中不稳定,检测其代谢产物TXB2和6-Keto-PGF1α能较好地反映体内两者的水平。本研究显示,模型组血浆 NO、6-Keto-PGF1α水平显著降低,ET水平显著升高,并且 NO/ET、6-Keto-PGF1α/TXB2值均降低,说明心理应激造成的内皮损伤导致了血管的舒缩因子释放失衡。
Adr是肾上腺髓质分泌的主要激素,当机体受到强烈刺激的时候,如兴奋、恐惧、紧张等,机体出现以交感神经兴奋、儿茶酚胺分泌增加及下丘脑—垂体—肾上腺皮质增多为主的一些列神经内分泌活动,以适应或对抗刺激对机体的伤害。这样的反应对机体既有防御意义又有病理意义[13]。肾上腺髓质适量的分泌Adr,可使机体呼吸加快,心跳与血液流动加速,瞳孔放大,为身体活动提供更多能量,使反应更加快速。但是,激烈的应激使垂体—肾上腺皮质系统和交感—肾上腺髓质系统持续兴奋,使血液中Adr的分泌增加并维持在较高水平,其强烈的缩血管作用可对血管的功能、结构造成损伤[13]。同时,在应激条件下,COR水平迅速升高,是应激反应中最重要的一种内分泌活动,其水平和持续时间与刺激强度有关,对机体抗损伤起重要作用,故COR的水平可作为反映应激强度的指标。有研究表明,在大量烧伤患者的休克期,血浆COR水平可以达到正常的3倍,经治疗后有所下降,但仍然高于正常[6]。在本研究中,空瓶刺激心理应激模型组血浆Adr、COR水平比对照组明显增高,这进一步说明大鼠在受到空瓶应激后产生了情绪反应及神经内分泌反应。
体内 Adr可在相关酶的作用下,脱氨生成H2O2、MA、FA等毒性代谢物,它们的生成如高于机体清除率,毒性物质进入血液循环的时间延长,能够损害 VEC 组织结构和功能[4.6]。临床研究显示,患有动脉粥样硬化、糖尿病血管病变者,其血浆FA浓度增高,同时伴有继发性内皮功能不全。FA和H2O2还可引起蛋白交联、氧化应激,进而损伤内皮[14]。本实验研究结果发现,模型组血浆中H2O2、MA、FA高于对照组。结合射电镜观察VEC的超微结构进一步发现,电镜下对照组VEC的线粒体膜完整,嵴清晰,基底膜下无水肿,而模型组VEC的线粒体嵴模糊,部分线粒体出现空泡,基底膜下基质增多,出现水肿。有研究结果表明,细胞对应激原的反应与应激原的性质、作用强度和细胞种类有关,如果刺激轻微以及时间短,则细胞可消除侵害,恢复到损伤前的状态。如果刺激不致达到致死量,则细胞会通过改变其结构和功能的适应性做出改变,受累细胞出现可逆性损伤,表现出代谢、功能及形态异常等变化。在线粒体,应激是引起其通透性转运孔开放,这可造成细胞内膜的屏障功能破坏,使得小于1.5 kDa的任何分子可以自由穿过线粒体膜,而蛋白质不能通过,因而导致其胶体渗透压改变,造成线粒体肿胀。更严重的损伤则会是线粒体内膜破坏,最终引起细胞的死亡[15]。透射电镜的结果,也进一步说明空瓶刺激心理应激引起了大鼠VEC损伤。
综上所述,从血浆COR、NO水平变化以及VEC分泌的舒缩因子及扫描电镜观察可知,空瓶刺激心理应激导致了大鼠VEC功能和结构的损伤。该模型操作方便、周期短,是较理想的心理应激性内皮损伤动物模型,能够为心理应激引发心血管疾病的发生、发展研究提供一种较好的模型。
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