CASP3基因多态性与川崎病及其冠状动脉损害易感性的关系

陈 伟，张宏艳，林书祥

(1天津医科大学研究生院，天津300070;2天津市儿童医院)

川崎病是一种免疫介导的儿童急性血管炎综合征，主要侵袭全身中型肌动脉，其中以冠状动脉受累最为严重，它可致冠状动脉扩张、冠状动脉瘤、狭窄甚至闭锁，已经成为许多国家儿童获得性心脏病的最常见原因［1］，其发病率近年来呈上升趋势［2，3］。国外研究表明，川崎病发病具有种族差异性和遗传易感性［3，4］。编码半胱天冬蛋白酶 3(Caspase-3)基因CASP3与川崎病易感性的相关性研究成为热点课题［5～8］，国内目前尚未见报道。本研究通过采用聚合酶链反应(PCR)对川崎病患儿及对照组儿童外周血CASP3 rs113420705位点基因多态性进行分析，旨在探讨CASP3基因多态性在中国汉族儿童中与川崎病及其冠状动脉损害(CAL)之间的关系。

1 资料与方法

1．1 临床资料 川崎病组:2010年10月～2012年4月在天津市儿童医院就诊的川崎病患儿40例，均符合日本厚生省川崎病研究课题组第5版修订川崎病诊断标准［2］，年龄2 个月 ～8岁(2．10 ±1．83)岁，男26例，女14例。受试者按冠状动脉损害标准［9］分为冠状动脉损害组(17例)和无损害组(23例)。对照组:天津市儿童医院健康体检儿童30例，年龄(2．32±1．75)岁，男18例，女12例，除外感染性疾病、免疫系统疾病、川崎病等疾病家族史。所有入组成员为汉族，籍贯为天津、河北及山东，在性别、年龄等方面无显著性差异(P均＞0．05)，具有可比性。本研究采取标本时获得所有患儿监护人的知情同意，并获得了天津市儿童医院伦理委员会的批准。

1．2 方法

1．2．1 CASP3 rs113420705位点基因多态性检测收取受试者(川崎病组为急性期清晨空腹采取)外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，－80℃冷冻保存。用DNA试剂盒(Promega公司)提取外周血基因组DNA，于－20℃保存备用。PCR扩增:根据NCBI公布rs113420705核苷酸序列用GENE RUNNER软件设计引物:上游引物5'-CGGAAGCAGTGCAGACGC-3'，下游引物 5'-CACTCCGCCTTCCAGACC-3'，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为50μL，含基因组DNA 4μL，MasterMix 22μL，ddH2O 22 μL，上下游引物各 1 μL。采用美国ABI公司2720型PCR扩增仪，反应条件:预变性95℃ 10 min，变性94℃ 30 s，退火64℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，变性、退火、延伸共30个循环，终末延伸72℃ 5 min。取5μL PCR产物，2．0%琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下鉴定产物。取182 bp处扩增条带阳性标本的PCR产物30μL，委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。应用Chromas软件分析所获测序结果。利用NCBI网站在线blast对所获序列进行对比分析。

1．2．2 统计学方法 采用SPSS17．0统计学软件，计数资料以例(%)表示，组间比较及组间人群基因分布Hardy-Weinberg遗传平衡检验采用χ2检验，检验水准双侧α=0．05。各组间CASP3 rs113420705位点等位基因型频率、基因型频率及各基因型的关联强度采用比值比(OR)表示，采用95%置信区间(CI)。

2 结果

2．1 PCR扩增结果 PCR产物电泳目的条带为182 bp，以50 bp Marker为核酸分子量参照标准，扩增产物目标条带在150～200 bp。见图1。

图1 PCR产物电泳图

2．2 CASP3 rs113420705基因型分布 参照NCBI网站SNP rs1801274，利用该网站在线blast对所获序列进行对比分析发现，所有研究对象检测到SNP rs113420705，基因型为 GG、GA及 AA 3种，见插页Ⅱ图2。其中病例组GG基因型12例，GA基因型19例，AA基因型9例;对照组GG基因型19例，GA基因型9例，AA基因型2例。川崎病组和对照组基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P均 ＞0．05)，表明各基因型频率已达遗传平衡，具有良好的群体代表性。

2．3 CASP3 rs113420705位点测序结果分析

2．3．1 川崎病组与对照组等位基因频率及基因型频率的分布 川崎病组A等位基因频率为37(46．3%)，对照组为13(21．7%)，差异有统计学意义(χ2=9．03，P ＜ 0．05;OR=3．11，95%CI:1．46 ～6．62)。A等位基因的OR值＞1，故A等位基因使川崎病发生的危险度增加。川崎病组AA基因型频率为9(22．5%)，GA 基因型为 19(47．5%)，GG 基因型为 12(30．0%)，对照组分别为 2(6．7%)、9(30%)、19(63．3%)，基因型分布在两组间差异显著(χ2=7．72，P ＜0．05)。携带 A 等位基因的 AA、GA 基因型的OR值均＞1(2．11、4．06)，表明携带A等位基因的AA、GA基因型使川崎病发生的危险度增加。

2．3．2 冠状动脉损害组和无损害组等位基因及基因型分布 冠状动脉损害组A等位基因频率为37(46．3%)，冠状动脉无损害组A等位基因频率为13(21．7%)，A等位基因频率在两组间差异无统计学意义(χ2=2．21，P ＞0．05，OR=1．97，95%CI:0．80～4．84)，而A等位基因的 OR值 ＞1，可见 A等位基因在一定程度上是川崎病患者冠状动脉损害发生的危险因素。冠状动脉损害组AA、GA、GG基因型频率分别为 6(35．3%)、7(41．2%)、4(23．5%)，冠状动脉无损害组分别为 3(13．0%)、12(52．2%)、8(34．8%)，携带A等位基因的AA、GA基因型频率在两组间无显著差异 (χ2=0．59，P ＞0．05)。其中AA 基因型 OR=3．64，95%CI:0．76 ～17．46;GA 基因型 OR=0．64，95%CI:0．18 ～2．28。可见携带 A等位基因的基因型在一定程度上使川崎病发生冠状动脉损害发生的危险因素增加。

3 讨论

川崎病作为一种自身免疫性血管炎，其发病机制仍尚不清楚。一个可能原因为自身免疫降低，多见于感染侵袭后细胞凋亡过程发展有缺陷的儿童［10］。因此，通过鉴定与细胞凋亡机制相关的遗传因素，将大大促进明确川崎病的病因。细胞凋亡是机体正常细胞在基因调控下的程序性死亡。T细胞异常活化是川崎病免疫损伤的关键步骤，在川崎病急性期外周血活化 T 细胞异常增高是由凋亡延迟所致［10，11］，而Caspase-3在T细胞凋亡中的作用至关重要［12］。

本研究应用PCR和直接测序方法，检测了40例川崎病患儿和30例健康儿童CASP3基因rs113420705，显示CASP3基因rs113420705突变位点为3种基因型 GG、GA、AA，突变基因型分别为GA、AA。本研究结果显示，CASP3基因rs113420705位点A等位基因可以导致川崎病发生的危险度增加(OR=3．11)。本组40例川崎病患儿中28例含有A等位基因，30例健康儿童中仅11例含有A等位基因，A等位基因频率在川崎病组与对照组间比较具有显著差异，含有A等位基因的儿童易发生川崎病，与Onouchi等［6］在日本人群和欧裔美国人群中得出的结论一致。

rs113420705位点位于CASP3基因5'非编码区区，其与周围碱基构成的GGAA序列类似于转录因子—活化T细胞核因子(NFAT)的结合位点，它能开启IL-2和其他细胞因子的转录。CASP3基因rs113420705位点为G等位基因时，其与周围区域可以与NFAT结合，并作为T细胞受体信号激活T细胞的增强因素，CASP3表达上调，而在川崎病患儿中，该位点 G变为 A，其增强作用减弱，影响NFAT的结合，CASP3基因的表达明显下降，使T细胞的凋亡受限，活化T细胞相应增多，启动了川崎病的发病［6］。当CASP3表达下降时，NFATc2裂解减少［13］，致使多种炎性因子增加，也促进了川崎病的发生。这些遗传变异又导致了炎性反应过程中T细胞增殖增加及凋亡下降，在川崎病急性期、亚急性期，外周血活化T细胞异常增高［14］，又为川崎病的发生提供了条件。

本研究还显示，CASP3基因rs113420705位点A等位基因导致川崎病发生冠状动脉损害的危险度增加(OR=1．97)，然而两组差异并不显著(χ2=2．21，P ＞0．05)，与 Onouchi等［6］在日本人群和欧裔美国人群中所得结论一致。

此外，Kuo等［8］在台湾人群中发现，CASP3基因rs113420705位点为A等位基因的川崎病患儿易发生冠状动脉瘤。本研究中发生冠状动脉瘤者例数偏少，未能进行相关性验证。Onouchi等研究显示，A等位基因频率在静脉用人丙种免疫球蛋白(IVIG)不敏感患者中显著增高［7］。本研究中所有患儿对IVIG敏感，未能进行CASP3基因与IVIG敏感性的相关比较，有待增加样本量后进一步研究。

总之，川崎病是一种多原因引起的免疫性疾病，研究表明其与基因多态性相关，然至目前为止，并未形成定论。本研究表明，CASP3基因多态性与中国汉族儿童川崎病易感性相关，与冠状动脉损害相关性并不明显，仍有待于研究者在样本量、人群等方面进行一步的综合分析。

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