抗感颗粒的HPLC 指纹图谱研究

2013-06-13刘元媛胡佳何涛

锦州医科大学学报 2013年6期

刘元媛，胡佳，何涛

(1.辽宁医学院;2.锦州市药品检验所，辽宁锦州 121000)

抗感颗粒为中国药典收录的成方制剂，具有清热解毒功效，用于治疗外感风热引起的感冒，症见发热、头痛、鼻塞、喷嚏、咽痛、全身乏力、酸痛［1］，是治疗感冒的常用中成药之一。2010 版中国药典对方中的芍药苷进行了含量测定［1］759－760，鉴于目前单一成分对中成药质量控制的局限性以及中成药多成分的复杂性，复方制剂的质量控制已经广泛的引入了指纹图谱研究方法［2－3］，为提高该方的质量标准，更全面的控制制剂质量，本试验探索了采用HPLC 法建立制剂的指纹图谱［4－8］，该方法准确可靠，为全面控制抗感颗粒质量提供依据。

1 仪器与试药

HITACHI 高效液相色谱仪;L－2100 高压输液泵;L－2450 二级管阵列检测器;芍药苷对照品(CAS 号23180－57－6)购自国家标准物质网，纯度＞98%;绿原酸对照品(批号 110753－200413)购自中国药品生物制品检定所;超声波清洗器;FA2004N 电子分析天平;甲醇为色谱纯，水为双蒸水;其它试剂均为分析纯;10 批抗感颗粒样品依据药典方法自行制备(批号为110501、110502、 110503、 110504、 110505、 110506、110507、110508、110509、110510)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱:Hypersil (ODS 5 μm，4.6 × 200 mm);流动相系统:甲醇 (A)—水(B)，梯度洗脱程序为:0～20 min 甲醇由25%升到35%，20～30 min 甲醇由35%升到45%，30～45 min 甲醇由45%升到80%，45～60 min 甲醇由80%升到90%;流速1.0 mL/min;检测波长240 nm;柱温25 ℃，进样量10 μL。

2.2 对照品溶液的制备取芍药苷对照品适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含0.407 mg 的溶液，即得。取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含0.146 mg 的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备取抗感颗粒粉末约1 g研细，加甲醇50 mL，密塞称定重量，超声15 min，称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，即得。

2.4 阴性液的制备按照处方工艺，分别制备缺金银花、缺赤芍、缺绵马贯众的样品，并按照供试品溶液的制备方法处理样品，得到金银花阴性液、赤芍阴性液及绵马贯众阴性液。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验精密吸取同一供试品溶液10 μL，按照拟定的色谱条件连续进样5 次，结果显示19 个共有峰的相对保留时间RSD ＜3%，相对峰面积的RSD ＜5%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别在0、2、4、6、8 h 进样5 次。结果显示19 个共有峰的相对保留时间RSD ＜3%，相对峰面积的RSD ＜5%，表明在8 h 内供试品溶液稳定性良好。

2.5.3 重复性试验取同一批抗感颗粒样品5 份，按供试品溶液的制备方法操作，分别取各供试品溶液10 μL，按拟定的色谱条件进样分析，结果显示19 个共有峰相对保留时间的RSD ＜3%，相对峰面积RSD ＜5%，表明重复性良好。

2.6 样品的测定取10 批抗感颗粒样品，按供试品溶液制备方法操作，精密吸取各对照品溶液及供试品溶液10 μL 进样分析。

2.7 指纹图谱的建立与分析

2.7.1 共有峰的确定本试验共测定了10 批抗感颗粒样品色谱图，结果显示各批样品均具有19 个特征峰，通过紫外光谱检测各峰一致，因此选择这19 个特征峰作为共有峰。同时通过对照品定位及紫外光谱检测，鉴定了两个共有峰，分别为4 号峰(绿原酸)和6 号峰(芍药苷)，并以6 号峰为参照峰计算各共有峰的相对保留时间与相对峰面积，结果见表1。

表1 10批抗感颗粒指纹图谱中共有峰的相对面积

2.7.2 峰位归属采用与对照品定位对照及紫外光谱分析，鉴定了2 个主要特征峰，其中峰4 为绿原酸，来源于金银花，结果见图1;峰6 为芍药苷，来源于赤芍，结果见图2。样品的阴性试验表明阴性液无干扰，结果见图3、4、5。通过将抗感颗粒制剂图谱与各单味药材图谱定位对照分析显示，峰2、3、4、5、7、8、13 归属金银花;峰1、6、11 归属赤芍;峰15 归属绵马贯众;峰9、10、16、17、18、19 为三味药材共有，产生2 个新的特征峰为峰12、14，结果见图6。

2.7.3 特征指纹峰的相似度计算与分析采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A 版)，得到10 批抗感颗粒的指纹图谱共有模式，结果见图7，计算10 批样品的相似度均大于0.9，结果见表2。

表2 10批抗感颗粒HPLC 指纹图谱相似度结果

3 讨论

3.1 本试验考察了以甲醇－0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液［9］、乙腈－0.4% 磷酸溶液［10］、甲醇－水［11］、乙腈－水系统为流动相进行梯度洗脱，结果以甲醇－水系统的洗脱效果较好，且方法简便易行。采用二极管阵列检测器进行了紫外扫描检测，比较了235、240、327、365 nm 波长下的色谱图，结果供试品在240 nm 检测波长下得到的色谱图检出峰数较多、分离效果良好，故选择240 nm 作为检测波长。考察了以水、甲醇为提取溶媒，以超声、回流为提取方法［11］3820－3821，通过提取后的含量比较，确定了采用甲醇为溶媒，超声提取的方法制备样品。

3.2 通过对全方及单味药材的色谱图对比分析表明，全方的特征峰主要来自金银花和赤芍，绵马贯众所含成分在检测条件下较少;并发现有两个新成分生成，可能为药材煎煮过程中产生的新物质，具体鉴定有待进一步研究。

3.3 本试验分析了10 批抗感颗粒的HPLC 指纹图谱，结果表明不同批次间均具有19 个特征峰，峰面积的相对含量相差不大，且总共有峰含量在85%以上，可以较全面的体现全方的特征;鉴定了绿原酸和芍药苷两个特征峰，并可以同时对其定量分析。本方法操作简单，重现性好，适合于对抗感颗粒的质量控制。