聚酰胺－大孔树脂联用富集杜仲雄花总黄酮

丁艳霞，郭洋静，曾令连，李 钦＊

（1.河南大学药学院 杜仲工程研究中心，河南 开封 475001；2.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）又名思仙、思仲、石思仙，为杜仲科杜仲属植物，落叶乔木，花单性异株，是仅存于我国的第三纪孑遗植物［1］，是中国珍稀濒危二类保护植物［2］，它的栽培历史悠久，广泛分布于甘、陕、晋、豫、湘、鄂、川、滇、黔、桂、皖、浙、赣、闽等省、自治区的平原到海拔1690m 间的丘陵和山地［3］。杜仲作为药材在我国已有2000多年的历史，我国第一部药书《神农本草经》记载了杜仲的药效：“杜仲性味甘、微辛、温、无毒，有补肝肾、强筋骨、益腰膝、除酸痛的效能”。肖静等通过提取杜仲皮中总黄酮，以25、50、100μg／mL 浓度分别加入新生Wistar大鼠颅骨分离培养的成骨细胞中，发现杜仲总黄酮能直接促进体外成骨细胞的增殖［4］。杜鹏等［5］报道，杜仲总黄酮能对抗维甲酸诱导的小鼠骨质疏松症，提高成骨细胞活性。国内外对杜仲黄酮类化合物的研究十分活跃，已有研究［6］表明，杜仲雄花中的总黄酮含量远高于杜仲皮和叶，关于其总黄酮的富集主要采用大孔树脂，黄酮纯度最高能达到33.9%（粗提物中黄酮纯度为3.28%）。本实验首次对聚酰胺－大孔树脂联用技术富集杜仲总黄酮进行了探讨，取得较好效果，富集物纯度提高近200倍，远优于目前常用的黄酮纯化技术。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UV－2100型紫外可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；XS225A型分析天平（瑞士普利赛斯公司）；GKC21CR4可控硅恒温水浴锅（上海锦屏仪器仪表有限公司）。

1.2 试药

X－5、HPD－100、AB－8、NKB－9、D－101大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司），柱色谱用聚酰胺（100～200 目）（国药集团化学试剂有限公司）；杜仲雄花药材购自洛阳市鸡冠山商贸有限公司，经河南大学药学院李钦教授鉴定均为杜仲科植物杜仲Eucommia uimoids Oliv.的雄花；芦丁对照品（中国药品生物制品鉴定所）；所用试剂均为分析纯。

2 分析方法的建立

2.1 对照品溶液的制备及线性方程

取105℃干燥至恒重的芦丁对照品约9.48mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，以体积分数为60%乙醇溶解定容成0.1896 mg.mL－1的溶液，即得。

分别吸取上述标准溶液0、0.4、0.8、1.6、2.0、2.4mL置于10mL容量瓶中，加入质量分数为5%的亚硝酸钠0.4mL，混匀，放置6 min，加质量分数为10%硝酸铝0.4mL，混匀，放置6min，加质量分数为4.3%的氢氧化钠4.0 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以空白为对照，用紫外可见分光光度计进行扫描，确定最大吸收波长为510nm，并在510nm 下测定各浓度标样的吸光值，求出标准曲线方程：Y＝11.314 X＋0.028，R2＝0.9997。

2.2 供试品溶液的制备及测定方法

取杜仲雄花粉末适量，25 倍量体积分数为70%的乙醇浸泡2h，浸泡液用超声波120 W，体积分数为70%的乙醇超声提取2次，每次20min。滤过，减压回收溶剂至无醇味，残渣用70%乙醇溶解，并稀释至质量浓度为0.016g／ml（按浸膏量计），作为上柱供试液，并按照文献方法［7］，测定药材中总黄酮的含量为3.2%。

3 结果与讨论

3.1 聚酰胺静态吸附量－解吸性能考察试验［8］

准确称取预处理好的聚酰胺5.00g，置于250mL具塞锥形瓶中，加入样品溶液（总黄酮浓度1.03 mg／ml）50mL，平行六份。每隔30 min振摇20s，每隔1.5h吸取上层液测定药液的吸光度，至剩余总黄酮浓度达到平衡，计算出每克干聚酰胺的吸附量（mg／g）。以时间为横坐标，吸附量为纵坐标，得到聚酰胺的吸附动力学曲线，见图1。经过考察，其吸附在0.5h内吸附速率最快，0.5～5h以内吸收变得缓慢，但6～15h后吸附的速率又一次加快快，到15h后趋于平衡状态。按式（1）计算吸附量和每克干聚酰胺的吸附量，结果表明：平衡状态时，5g聚酰胺树脂的静态吸附量为37.71mg。

吸附量＝原液总黄酮量一剩余总黄酮量（1）

图1 聚酰胺静态吸附动力曲线图

3.2 聚酰胺动态吸附量－解吸性能考察

将3.1 项预处理的饱和吸附黄酮的聚酰胺5.00g，装入内径为1.5cm的层析柱，分别用蒸馏水、体积分数为20%、40%、60%、80%、95%的乙醇各100ml，以流速为2BV／h对雄花药液（总黄酮浓度1.03mg／ml）50 ml进行冲洗，收集各洗涤液，按照供试品溶液的测定方法测定各溶液的吸光度（A），计算动态解吸量及解吸率。结果表明：用体积分数为80%的乙醇洗脱，能使黄酮的解析量达到33.01mg，解析率达到87.5%。

表1 聚酰胺对黄酮的动态吸附量－解吸情况

表2 不同型号大孔树脂对总黄酮吸附洗脱效果

3.3 大孔树脂型号的筛选

准确取等量不同型号大孔树脂，预处理后装柱，以水洗脱至流出液近无色。加入样品溶液（总黄酮浓度0.639mg／ml）后吸附12h，然后用体积分数为70%乙醇洗脱，收集70%醇洗脱液6BV。测定洗脱液的吸光度，计算总黄酮的量和收率，结果见表2。由表可知，5种树脂中非极性的D－101树脂在总黄酮的量和收率方面效果最好，因此，选用D－101作为实验优选树脂［9］。

3.4 大孔树脂洗脱溶剂的初步考察

精密量取供试品溶液适量（约相当于2.0g浸膏），以水洗至流出液近无色（6BV）后置于预先以水为溶剂填装的大孔吸附树脂柱上部，依次用体积分数为15%、30%、45%、60%、75%、85%、95%乙醇洗脱，分别收集洗脱液6BV，测定洗脱液中固形物量和总黄酮量，计算黄酮质量分数和收率。结果见表3。结果表明，体积分数为15%～60%乙醇洗脱部分，总黄酮收率已经达到65.72%，体积分数为75%的乙醇并没有明显增加总黄酮的收率。

表3 大孔树脂不同洗脱溶剂对总黄酮的洗脱效果

3.5 聚酰胺与大孔树脂连用最佳洗脱溶剂的考察

用体积分数为80%的乙醇洗脱聚酰胺，能使黄酮的解析量达到33.01mg，解析率达到87.5%，而D－101大孔树脂的动态解吸附效果显示体积分数为60%的乙醇就能使总黄酮收率已经达到65.72%，因此有必要进一步筛选洗脱溶剂的浓度。精密量取供试品溶液3份，分别拌入等量干燥聚酰胺粉末中，挥去溶剂后，置于3个小渗漉筒中，用水洗至流出液近无色（6BV）后分别置于以乙醇为填装溶剂的D－101大孔吸附树脂柱上部，分别用体积分数为60%、70%、80%乙醇洗脱，收集洗脱液各6BV，测定洗脱液中固形物量和总黄酮量，计算黄酮质量分数和收率。结果见表4，体积分数为60%的乙醇能使总黄酮的收率达到77.14%，增加洗脱溶剂的浓度反而使黄酮的收率下降，因此选用体积分数为60%的乙醇作为最佳洗脱浓度。

表4 聚酰胺与大孔树脂连用时不同洗脱溶剂对总黄酮的洗脱效果

3.6 正交试验

采用L9（34）正交试验根据黄酮理化性质和大孔树脂洗脱特性，考察了上样药液浸膏－聚酰胺比例（A）、洗脱液收集量（B）、浸膏－大孔树脂比例（C）3个因素，进一步设置3水平，进一步优化筛选。测定洗脱液总黄酮的量，计算其总黄酮纯度和收率作为评价指标，进行方差分析。结果表明，这三种因素对试验结果的影响大小顺序为A＞B＞C，最佳纯化工艺条件为A3B2C1，即上样浸膏－聚酰胺比例1∶3，浸膏－大孔树脂比1∶10，收集洗脱液6BV。通过方差分析，浸膏－聚酰胺、浸膏－大孔树脂的比值对试验结果具有显著影响，而洗脱溶剂用量则无显著影响。

总黄酮纯度＝洗脱液中总黄酮量／洗脱液固形物量

总黄酮收率＝洗脱液中总黄酮量／上柱前药液中总黄酮量

表5 三因素水平设置

表6 正交试验筛选结果

表7 方差分析

3.7 验证试验

按最佳纯化工艺重复实验3 次，结果3 批样品总黄酮收率为（86.76±2.3）%，质量分数为（55.27±3.6）%。结果表明，聚酰胺.大孔树脂联用分离纯化杜仲雄花总黄酮的工艺稳定可行。

4 结果与讨论

4.1 结果

聚酰胺与D－101 树脂联合应用能很好的富集杜仲雄花总黄酮。最佳工艺条件为浸膏与聚酰胺比为1∶3，浸膏与大孔树脂比为1∶10，以体积分数为60%乙醇洗脱，收集洗脱液6BV。富集物总黄酮收率可达86.76%%，黄酮纯度为55.27%。该方法优于目前常用黄酮富集，且工艺简单，树脂再生容易，具有良好的运用前景。

4.2 讨论

聚酰胺、大孔吸附树脂是分离黄酮类物质的常用材料，由于其吸附机制不同，两者在分离纯化中各有优缺点。在实验中发现，将聚酰胺与大孔吸附树脂联用可充分发挥两者优势，弥补不足。本实验选择以聚酰胺作吸附剂，一方面，经水洗可除去大部分水溶性杂质，另一方面，聚酰胺对色素及部分脂溶性成分仍保持较好的截留，减轻了对大孔树脂柱的污染和负担。经初步分级的上柱液再经大孔树脂纯化，再利用树脂吸附和分子筛作用即可极大地提高产物的纯度。这种方法操作简单，柱再生方便，黄酮富集率高，具有广阔的市场应用前景。

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