Innexin 通道蛋白功能研究进展

李 明，杨 洋，张 艳，庞尊玉，罗开珺

(云南大学生命科学学院，云南省高校动物遗传多样性和进化重点实验室，昆明 650091)

在多细胞生物中，相邻细胞膜上的hemichannel 对接形成的GJ，是细胞之间的连接方式之一，属于膜通道结构，参与介导相邻细胞间的信号传递。在脊椎动物中，构成hemichannel 的是connexin(Cx)和pannexin(Px);在无脊椎动物中，形成hemichannel 的间隙连接蛋白被命名为innexin(Inx，为Px 蛋白的同源物)。目前大约有21种 connexins 基 因(Cruciani and Mikalsen，2007)、3种pannexins 基因(Panchin et al.，2000)和25种innexins 基因(Scemes et al.，2009)被克隆出来。这三类蛋白形成的hemichannel 有着相似的拓扑结构:一个hemichannel 由六个跨膜蛋白组成，一个蛋白由四个跨膜结构域、两个胞外环、一个胞内环以及一个N 端和一个C 端构成。其中connexin(Cx23 除外)的胞外环有6个保守的半胱氨酸残基，innexin 的胞外环有4个保守的半胱氨酸残基(见图1)。这些相似的结构提示它们在形成GJ 的过程中有类似的连接方式。最近研究显示，Cx 蛋白组成的hemichannels 不仅仅是作为Gap junction 的亚单位，该蛋白还具有酶和转运体的双重功能，能独立于 GJ 存在于胞膜上形成hemichannels，作为胞内与胞外小分子的通路，参与细胞的信号转导和维持细胞正常生理状态(Vinken et al.，2006;Vinken et al.，2011)。无脊椎动物的innexins 研究不如哺乳动物的广泛，近几年，随着昆虫当中innexins 蛋白被逐步克隆得到，对其功能的研究也逐渐展开。本文主要就Inx 蛋白自身及其形成的hemichannels 两个方面的研究进展作一综述。

图1 Innexin 蛋白、半通道和缝隙连接分子结构示意图Fig.1 Molecular architecture of innexin，hemichannel and gap junction

1 Inx 蛋白的研究

1.1 Inx 蛋白研究概述

Inx 基因在动物体内的分布比较广，与之相关的研究最先是从果蝇和家蚕中展开的。被命名为Orge 的蛋白是最初被研究的Inx 蛋白，像Shanking B、unc、eat 蛋白其实也是属于Inx 蛋白家族，只是当时由于并不清楚此类蛋白究竟归于哪一类蛋白，且对其结构域没有统一的进行分析，所以蛋白名称存在多样化(Phelan et al.，1998)。之后，越来越多的类似基因在无脊椎动物当中被克隆得到，并且随着研究的深入，生物信息学的发展，发现此类蛋白与脊椎动物的Cx 蛋白相比，两者有着相似的跨膜结构和类似的功能，因而人们才将无脊椎动物当中的这类蛋白称之为 innexin(Phelan，2000;Phelan and Starich，2001;Yen and Saier，2007)。从此，Inx 蛋白成为了构成GJ 的另一类通道蛋白。生物信息学的分析表明，昆虫的Inx 蛋白在第二个跨膜区域前端具有特征序列YYQWV，并且是完全保守的(Hua et al.，2003)。越来越多的研究表明，Inx 蛋白具有多重功能，除了传统上的参与构建GJ 介导相邻分子的信号传导外，其本身的功能研究也越来越受到重视。

1.2 Inx 蛋白的表达分布及功能探讨

对于Inx 蛋白的功能研究在果蝇的胚胎发育与形态发生上较为集中，其次是在线虫、家蚕、蝗虫等物种上。在果蝇中，Bohrmann和Zimmermann(2008)研究显示，在果蝇卵子的发育过程中，Inx1 主要分布于卵泡细胞的底部两侧，Inx2 定位于顶部两侧，Inx3 在卵泡细胞和滋养细胞的两侧有观察到，Inx4 在5 期的卵膜细胞和12 期的滋养细胞膜上有检测到，而且Inx2和Inx3、Inx2 于Inx4 之间的表达分布还存在协同作用。Tazuke 等(2002)发现，果蝇早期正在分化的生殖细胞的存活需要inx4 基因的表达;Bauer 等(2004)的研究发现inx2 对胚胎上皮组织的形态发生是必须的;而ogre and shaking B 对果蝇目视系统的正常形成(Phelan，2005)、shakB 对感觉神经元和突触之间的电传导的作用(Trimarchi and Murphey，1997)、inx2 控 制 果 蝇 胚 胎 前 肠 的 发 育(Bauer et al.，2002)等方面都发挥着重要作用。在线虫中，目前已经有25个inx 基因被克隆得到(Phelan and Starich，2001;Scemes et al.，2009)，当这些基因发生突变时，会影响到线虫的发育或某些组织器官的功能。如Chuang 等(2007)研究发现nsy-5在线虫胚胎神经系统发育和神经系统左右极的不对称分化的过程中有大量的表达。Starich 等(Starich et al.，1996;Phelan and Starich，2001)认为unc-7和unc-9 同时突变会导致线虫运动缺陷，并改变线虫对麻醉剂的敏感性和对驱虫剂双氢除虫菌素的耐药性;基因eat-5和inx6 在线虫咽部表达，对肌肉的同步收缩是必不可少的(Starich et al.，1996;Li et al.，2003);而线虫的胚胎发生需要inx3 基因的表达(Starich et al.，2003)。Ganfornina 等发现Inx1 蛋白主要对蝗虫的胚胎神经系统，特别是神经的前期发育方面起着重 要 作 用(Ganfornina et al.，1999)。Hong 等(2008)的研究报告表明，家蚕中的inx2 基因在胚胎发育的整个过程都起作用，特别是在神经系统中有高表达;而Inx4 蛋白主要在家蚕幼虫和蛹期阶段的睾丸和卵巢组织中含量丰富，提示inx4 基因对家蚕生殖系统的发育有重要作用。

1.3 Inx 蛋白之间的相互作用

通道蛋白在形成通道的过程中或形成通道以后，更多的是受到其它信号分子或蛋白酶的调控。但近来有研究表明，Inx 蛋白之间还存在相互作用，而且这种相互作用对一些组织的发育或信号的传递起着重要的作用。Chen 等(2007)在研究GJ 对线虫发育和神经系统功能的调控作用过程中发现，UNC-1 可能调节UNC-9 的功能或分布，UNC-9 蛋白在膜上可以形成同聚体半通道，相邻的两个细胞进而形成GJ，而UNC-9 通道的开关却受到UNC-1 蛋白调控。当UNC-1 蛋白存在时，可以跟UNC-9亚体结合，此时通道打开;当UNC-1 不存在时，通道关闭(图2)。但当UNC-9 与GFP 以融合蛋白的形式表达时，形成的通道将一直保持开放状态(组成型开放通道)，这可能是由于GFP 蛋白的存在对UNC-9亚体之间的结合产生了位阻现象，起到了UNC-1 蛋白的类似作用。Lehmann 等人(2006)的研究表明，Inx2蛋白和Inx3 蛋白在膜上的分布和定位是相互影响的，这一点也得到了Bohrmann和Zimmermann 两人的证实(2008)。当沉默inx2 基因的表达时，Inx3 蛋白会在细胞中积累并分布紊乱，反之亦然。inx2和inx3 基因协同表达后通过细胞内的C 端功能域相互作用形成异聚化的Inx2:Inx3 通道，这对果蝇胚胎的上皮组织发育和胚胎表皮极性的形成起着关键作用。如果inx2 或inx3 发生突变，会导致表皮上有大的皮孔形成，极端情况下甚至导致外皮的缺失。该研究组通过配体系统进化技术(SELEX)筛选出 anti-innexin2的适配体(aptamer)，该适配体可以抑制Inx2和Inx3 在C 端功能域的相互作用，进一步证实了Inx2和Inx3 之间相互作用的机制(Knieps et al.，2007)。

2 Inx－hemichannel 的研究

2.1 Inx－hemichannel 介导信号分子的释放

Inx-hemichannel 具有双重功能，除了两个相邻的hemichannel 对接形成GJ 外，其本身也可以形成功能性的non-junctional 膜通道，这些膜通道可以介导释放各种小分子物质(Bao et al.，2007)。ATP 是细胞内最重要的能量分子，也是参与细胞间信息传递的重要信号分子，在外界环境或内环境发生变化的情况下如低氧、离子浓度改变、pH等因素的刺激下细胞释放ATP 增加。既往研究提示Cx 或Px 蛋白组成的GJ/hemichannel 可能参与ATP 的 释 放(Bao et al.，2004;Vessey et al.，2005;Thompson et al.，2006;Iglesias et al.，2009)。Bao 等(2007)的研究显示在爪蟾卵母细胞中表达Inx 蛋白形成的hemichannel 传导功能类似于Px-hemichannel，而与Cx-通道有所不同。inx2、inx3 或inx6 表达后，可以记录到约500pS 的通道电流(Px1 在爪蟾卵母细胞中表达记录到的通道电流为550pS 或475pS)。当细胞发生高钾去极化时通道开放，ATP 释放增加;而pH 下降如暴露在CO2时则起到抑制作用。与Px-hemichannel 一样，ATP 的释放也都能被GJ 通道阻断剂生胃酮(carbenoxolone，CBX)阻断，提示ATP 的释放可能由Inx-hemichannel 介导。Luo和Turnbull 利用荧光染料吸收的方法首次在昆虫细胞中证实了存在有功能性的Inx-hemichannel 通道，结果显示不同的条件下通道的活性会发生改变(Luo and Turnbull，2011)，与Bao 等人在蚂蟥中的研究结果一致(Bao et al.，2007)。研究中还发现，脂多糖(LPS，来自于革兰氏阴性菌)会抑制昆虫细胞Inx-半通道的活性，而这种物质对哺乳动物白细胞Cx-hemichannel 的活性有着复杂的影响(De Maio et al.，2000;Oviedo-Orta et al.，2000;Temme et al.，2000)。这提示Inx-hemichannel 介导的信号分子释放可能参与了免疫反应的信号传导，这在Samuels 等的研究中得到了进一步的证实，结果显示在蚂蟥神经系统中通过Inx-通道释放的ATP 控制着小胶质细胞(一种神经免疫细胞)向神经受损处的迁移(Samuels et al.，2010)。

钙波也是细胞通讯的一个重要方式，参与多种生理活动过程。Px-通道参与钙波的传递得到了越来越多研究结果的证实(Thompson et al.，2006;Vanden et al.，2006;Peters et al.，2007)。Px-通道不但存在于细胞膜上，也可能存在于内质网膜上(细胞内通道)，在受到缺血等刺激的情况下，不但释放ATP，还可能释放钙离子和一氧化氮等信号分子。与Px 蛋白类似，同源的Inx-通道也极可能参与了钙波和其他信号分子的传递。Bouhours 等(2011)的研究提示，作为Inx 蛋白家族成员之一的UNC-7 蛋白构成的细胞膜通道或细胞内通道在特定的生理条件下可能影响着细胞内ATP、钙离子或其它离子浓度的变化，进而对其他的生理功能产生影响。

2.2 Inx－hemichannel 与细胞凋亡

Elliott 等(2009)发现ATP 或UTP 可以作为开始凋亡的细胞释放的一种信号，以吸引巨噬细胞，但这个信号通过何种途径释放到细胞外，当时并不是很清楚。随后，Chekeni 等(2010)通过CBX 阻断和RNA 干扰实验结合膜片钳技术，发现ATP 或UTP 是通过Px1-通道释放的。当通过ATP或UTP 信号途径激活凋亡蛋白半胱天冬酶3(caspase3)时，激活的caspase3反过来作用Px1蛋白的C-末端，使得Px1 通道组成型开放，最终导致细胞凋亡。作为Px 蛋白的同源物，Inx 蛋白在无脊椎动物细胞是否介导了细胞的凋亡，目前还未见报道。作为一类功能保守的蛋白，根据Px1-hemichannel 介导了细胞凋亡已获得证实的报道，我们可以合理推测Inx-hemichannel 也参与了细胞凋亡的信号通路。Luo 等人的最新研究表明，在家蚕细胞Bm12 中过量表达inx2和inx3 基因，细胞出现聚集和粘附现象，这与昆虫细胞在受到外源刺激或侵入时出现的集结和包囊作用相符合;在草地滩夜蛾Sf9 细胞中过量表达inx2和inx3 基因，细胞表现出凋亡特征(出现凋亡小体)，而昆虫免疫细胞正是通过集结和包囊后的细胞凋亡来清除外源病毒等侵入物(待发表资料)。所以，从这一点来看，Inx-hemichannel 也参与介导了细胞免疫反应。

2.3 Inx－hemichannel 开放的调控

在正常的生理状态下，细胞膜上的hemichannel 大多处于关闭状态，以保持细胞内容物和细胞体积的相对稳定。Px1-hemichannel 一方面可以通过释放ATP 作用于相邻细胞P2Y 受体产生第二信使三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)，IP3 诱导内质网释放Ca2+使细胞内Ca2+浓度增高;另一方面，ATP 也可以通过激活P2X7 受体使细胞内Ca2+浓度增高，P2X7 受体的激活或细胞内Ca2+浓度增高都可以诱导Px1-hemichannel的 开 放(Locovei et al.，2006;Pelegrin and Surprenant，2006;Locovei et al.，2007)。而Cx-hemichannel 在细胞外Ca2+浓度下降时通道开放增加，Ca2+浓度升高时通道开放减少(Li et al.，1996;Zhang et al.，2006;Verselis and Srinivas.2008)，pH 下降时减少通道开放(Trexler et al.，1999)。在Inx-hemichannel 中，当升高细胞外液Ca2+浓度或Mg2+浓度时，Inx-hemichannel 的开放增加;当LPS 免疫刺激时，Inx-hemichannel 开放减少(Bao et al.，2007;Luo and Turnbull，2011)。这些研究结果显示hemichannel 的开放与阳离子浓度特别是Ca2+浓度的变化相关，而Ca2+浓度的变化与calmodulin(钙调蛋白)的活性密切相关。当细胞内Ca2+浓度升高时可以激活calmodulin，calmodulin 再与通道蛋白相互作用调控通道的开关(zhang et al.，2006;Decrock et al.，2011)。在线虫细胞中，Inx-hemichannel 的开放和关闭还与Inx 蛋白之间的相互作用有关，当UNC-1 与UNC-9 结合时，通道开放，分开时通道关闭(图2)。根据Px1 蛋白的研究结果(Chekeni et al.，2010)，我们也可以推测，Inx 蛋白组成的hemichannel 也可能是Caspase 蛋白酶的作用靶标，当其被激活的Caspase 剪切后，会造成Inx-hemichannel 的永久性开放。

图2 UNC-1 与UNC-9 相互作用模式图(Chen et al.，2007)Fig.2 The interaction of UNC-1 and UNC-9(Chen et al，2007)

3 展望

集合了Cx 蛋白和Px 蛋白两类蛋白功能的Inx蛋白，其被研究的程度还不如前两者，但也受到越来越多学者的关注。目前研究显示Inx 蛋白具有多重功能，主要体现在Inx 蛋白本身、Inx-hemichannel和Inx-GJ 三个方面。Inx-GJ 在胚胎发育、形态发生、器官形成、生理活动的协调、信号传递等方面的功能基本得到了共识(Vinken et al.，2011)。而作为Px蛋白同源物的Inx-hemichannel 的功能，目前虽然研究成果不是很多，其功能活动的存在还是得到了部分的证实，但还有诸多问题有待阐明，比如Inx 通道的开放除了允许ATP、Ca2+等小分子的通过外，还可以介导哪些信号分子的释放;数量超过25种的Inx 蛋白是根据什么方式来组成同源型或异源型通道的，其之间的相互作用是怎样的?hemichannel 在细胞内部的分布情况和功能活动又是如何的?在病理情况下该通道的组装和开放情况如何等都值得深入探讨。Inx 蛋白本身的功能目前争议还比较大，主要的争论点在于利用目前的研究手段，比如敲除或沉默相关基因表达时，其表现出来的功能缺陷是由于蛋白本身引起的，还是由于在缺少该蛋白时不能正常组装hemichannel 或GJ 时引起的。但随着研究手段的改进和完善以及研究的深入，Inx 蛋白及其组成的hemichannel 的更多功能将被阐释，Inx 蛋白可能成为昆虫病虫害防治的干预靶点。

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