针刺郄门穴对心肌缺血大鼠作用及相关机制的实验研究

蒋莉娅，黄继人，诸静芬，戴建良，张卫东

(1.无锡市第二人民医院中医科，江苏 无锡 214002;2.无锡市中西医结合医院心内科，江苏 无锡 214041;3.无锡市中医院心内科，江苏 无锡 214001)

世界卫生组织预测，到2030年缺血性心脏病将成为威胁人类健康的第二大疾病，其中冠状动脉梗塞引起的心肌缺血是缺血性心脏病中最重要的致死原因。心肌缺血可以启动一系列的病理生理过程，导致心脏功能障碍。冠脉梗塞后尽早对缺血区进行有效的血液再灌注，是减少心肌细胞死亡、改善心脏功能惟一有效的方法。

中医治疗经验提示，针刺郄门穴可稳定心律、改善心肌缺血症状，但其机制临床却少见报道。研究[1]表明，电针郄门穴可明显减慢室性心动过速模型大鼠的心率，升高其血浆中一氧化氮(NO)含量，其可能机制是电针郄门穴通过抑制心脏交感神经，兴奋迷走神经，增加NO的释放，最终减慢心率。本实验通过针刺心肌缺血大鼠郄门穴，观察其心脏动力学和标准导联Ⅱ导心电图变化，并检测血浆NO量以及心肌细胞中凋亡相关基因Bcl-2、BAX表达，旨在从心功能、NO和心肌细胞凋亡等多方面探讨其治疗心肌缺血、保护心肌细胞的作用机制，并为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

NO测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所;BL-420四通道生物机能实验系统购自成都泰盟科技有限公司;华佗牌0.38mm×13mm不锈钢无菌毫针购自苏州医疗用品有限公司;BS110S电子分析天平购自德国赛多利斯公司;601型超级恒温水浴箱购自江苏省金坛市医疗仪器厂;TGL-20M台式高速冷冻离心机由长沙平凡仪器仪表有限公司提供;Odyssey红外成像系统购自Rockland公司。蛋白定量试剂盒购自申能博彩生物技术有限公司，Bcl-2一抗为兔抗大鼠多克隆抗体，Bax一抗为小鼠抗大鼠单克隆抗体，β-actin一抗为小鼠抗大鼠单克隆抗体，以上一抗均购自英国 Abcam公司。二抗为IRDye 800 conjugated affinity purified goat anti-mouse IgG和IRDye 800 conjugated affinity purified goat antirabbit IgG购自Odyssey公司。

1.2 实验动物

3个月龄健康清洁级SD大鼠80只，雌雄各半，体质量250±20g。雌雄动物分笼饲养，自由饮水，喂标准颗粒饲料，室温20±2℃。动物及饲料均购自南通大学实验动物中心。

1.3 分组与干预模型制作

大鼠随机分为正常组、模型组、合谷组及郄门4组，每组20只。大鼠经腹腔注射10%水合氯醛麻醉，仰卧位固定。纵行切开颈部皮肤及皮下组织，行气管插管术，保持气道通畅。成功后接麻醉机辅助呼吸，潮气量12ml/kg(约300ml)，呼吸频率14次/min，吸呼比1∶2。经舌下静脉注射垂体后叶素，5s内注射完毕，正常组给予等量生理盐水。一般在20s内即出现明显心电图改变，以T波高耸、ST段移位等作为模型复制成功标准[2]。采用 BL-420生物信号采集系统同步记录大鼠Ⅱ导联心电图，并用YH-4生理压力传感器经股动脉、颈总动脉记录股动脉血压和左心室内压，以获取心率(HR)、室内压最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室收缩压力峰值(LVSP)等心功能指标变化情况。

1.4 针刺操作

穴位定位参照《实验针灸学》[3]。模型复制后2～3min，选择各项生理指标平稳的时间点作为0min开始标记，分别在郄门组大鼠两侧“郄门”穴(前肢内侧，离腕关节约6mm的尺桡骨缝间取郄门穴)、合谷组大鼠两侧“合谷”(前掌背侧，第一二掌骨间凹陷处)，采用0.25mm×50mm银质毫针垂直刺入，深度约7mm，得气后开始记录时间。留针时，先均匀捻针1min，捻转幅度左右不超过180°，频率为120次/min，然后停止捻针 1min，开始第 2次捻针1min，接着又停止捻针1min，如此反复5次，5min后起针(从开始计时起)。

1.5 检测指标和方法

大鼠各项生理指标平稳后，运用KY-8系统同步记录其呼气末的ECG、心阻抗图(ICG)3～5个心动周期。造模及起针后，即刻按照针刺前方法再次同步记录3～5个心动周期的ECG和ICG。所有的参数均由计算机自动分析打印。所运用的心脏动力学方面的参数有:心搏出量(SV)、心搏指数(SI)、心搏功指数(SWI)、心输出量(CO)、心脏指数(CI)、心功指数(CWI)、瞬间左室收缩速度变化率(dv/dt)、瞬间左室收缩速度变化率(dp/dt)、冠状动脉灌注压(CPP)、肺毛细血管楔压(PWP)、硬度指数(Ks)、扩张指数(C)、舒张末期左室容积(Vi)、外周总阻力(TPR)[4]。观察并记录正常组同步喂养1周后的心脏动力学指标，模型组造模后5min测值，郄门、合谷2组针刺治疗结束后立即测值。正常组测完心脏动力学指标后直接心脏取血3ml，模型组心脏取血在造模成功15min后进行，郄门、合谷2组心脏取血在针刺治疗结束并观察心脏动力学测值10min后进行。4组大鼠均采用硝酸还原酶法测定 NO含量，其中模型组、郄门组、合谷组在心脏取血即15min后立即进行检测，步骤按试剂盒说明书操作[1]。

1.6 Western blot

郄门、合谷2组针刺治疗结束后60 min各组取心脏，生理盐水洗涤数次，取左心室心肌100mg至液氮中。将液氮冻存的组织样品研磨，然后加入1 ml的 RIPA 裂解液[150 mM NaCl，1%NP40，0.5%sodium deoxycholate，0.1% SDS，50 mM Tris(pH 7.9)，10 mM NaF，PMSF and 1 × protease inhibitors(Complete cocktail tablets，Roche)]进行匀浆，将匀浆液转移至1.5ml离心管，16000g离心30min取上清，用BCA法测上清蛋白浓度。灌制6%的浓缩胶和12%的分离胶，每泳道加总蛋白量50μg进行电泳分离，经湿转印到 PVDF膜上(Bio-Rad公司，美国)，在含有5%脱脂奶粉的 TBST(10 mM Tris–HCl，pH7.5，150 mM NaCl，and 0.1%Tween-20)溶液中常温封闭1 h，然后分别加入兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体及小鼠抗大鼠Bax、β-actin单克隆抗体(1∶1000稀释)，4℃孵育过夜，然后加入 IRDye 800相应标记的二抗(1∶2000稀释于PBS)，4℃孵育过夜，TBST洗涤，Odyssey红外成像系统扫膜。Bcl-2和Bax的相对含量用Bcl-2和Bax/β-actin灰度比值表示，灰度采用 QuantityOne软件分析(Bio-Rad公司，美国)。

1.7 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计，计量数据以均数±标准差(s)表示。各实验组间以及时间点的比较采用均值比较，一维方差分析，因子和因变量列，进行方差齐性检验，P＜0.01或P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组大鼠心脏动力学参数

表1显示，郄门组针刺治疗后心脏动力学指标:心搏出量(SV)、心搏指数(SI)、心搏功指数(SWI)等均获得明显改善，且结果优于模型组和合谷组(P＜0.01)。

2.2 4组大鼠血浆NO含量比较

表2显示，4组大鼠血浆 NO比较，模型组较正常组明显降低(P＜0.01)，郄门组较模型组及合谷组均明显升高(P＜0.01或 P＜0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 4组治疗前后标准导联Ⅱ导心电图变化

3 讨论

心血管病已成为我国城市和乡村人群的第一位死亡原因[5]，其中以动脉粥样硬化为基础的缺血性心血管病(包括冠心病和缺血性卒中)发病率仍在不断升高。心肌缺血、心肌梗死是心血管疾病中最常见的病症，目前仍缺乏有效的治疗手段，故寻找一种安全有效的抗心肌缺血药物或手段尤为重要。中医认为，针刺郄门穴对心肌缺血相关功能有影响，但其机制尚不十分清楚。本实验通过监测针刺心肌缺血大鼠郄门穴的心脏动力学指标和血浆NO含量，以及心肌细胞中凋亡相关基因的变化，从而探索针刺郄门穴对心肌缺血的保护作用机制。

表1 4组大鼠心脏动力学参数(s)

表1 4组大鼠心脏动力学参数(s)

注:与正常组比较:*P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.01;与合谷组比较:△P＜0.01

组 别 例数(n)心脏动力学指标SV(V/mL/beat－1)SI(mL/m2·beat－1)SW(kg·m/m2·beat)CO(qm/L·min －1)CI(L/m2·min)正常组 20 73.493±9.734 40.923±6.691 0.005±0.001 5.521±0.337 0.071±0.015模型组 20 49.815±11.315* 31.375±7.127* 0.003±0.001* 3.149±1.126* 0.046±0.021*郄门组 20 66.387±12.964#△ 36.669±9.824#△ 0.004±0.001#△ 4.332±1.701#△ 0.059±0.045#△合谷组 20 54.763±11.296 32.397±9.961 0.004±0.001 3.961±1.064 0.049±0.032组 别 例数(n)心脏动力学指标CWI(kg·m/m2·min)dv/dt(Sec2×10－2)dp/dt(p/kPa·s－1)CPP(p/kPa)PWP(p/kPa)正常组 20 2.973±0.041 89.926±6.290 110.463±5.041 9.887±0.216 1.341±0.001模型组 20 1.906±0.069* 116.571±21.931* 126.987±11.329* 9.275±0.065* 1.625±0.017*郄门组 20 2.349±0.091#△ 90.493±21.765#△ 114.417±18.726#△ 9.576±0.035#△ 1.445±0.035#△合谷组 20 2.015±0.079 106.463±22.321 119.876±12.371 9.334±0.078 1.501±0.021组 别 例数(n)心脏动力学指标C(ml/kPa)Ks(p/kPa·ml－1)Vi(V/ml)TPR(dyn·s·cm － 5)正常组 20 51.024± 0.091 0.021±0.001 106.735±10.657 2620± 689 1672± 665模型组 20 31.491±12.352* 0.031±0.008* 71.618±18.213* 2780± 817*郄门组 20 39.397±21.486#△ 0.023±0.011#△ 85.456±20.612#△ 2011±9134#△合谷组 20 32.523±20.172 0.029±0.043 79.973±12.421

图1 A.正常组;B.模型组;C.郄门组;D.合谷组

2.4 4组治疗前后Bcl-2和Bax表达变化

图2 Ⅰ.心肌细胞中Bcl-2和Bax表达;Ⅱ.Bcl-2相对表达变化统计;Ⅲ.Bax相对表达变化统计;Ⅳ.Bcl-2/Bax相对表达变化统计;A.正常组;B.模型组;C.郄门组;D.合谷组

表24 组大鼠血浆NO含量比较(μmol/L，s)

表24 组大鼠血浆NO含量比较(μmol/L，s)

注:与正常组比较:*P＜0.01;与模型组比较:#P＜0.01;与合谷组比较:△P＜0.05

NO正常组 20 —15min 33.198±2.231 38.601±1.732模型组 20 造模成功后15min 32.681±2.297*郄门组 20 造模成功后15min 35.491±3.371#△合谷组 20 造模成功后

中医学认为，本病属“心悸”、“胸痹”范畴，主要病机是气滞、血瘀、寒凝及痰阻导致胸阳不振、心脉痹阻。郄门穴是手厥阴心包经的郄穴，“郄主急”，具有缓急止痛和急救的作用。《针灸甲乙经》记载:“郄门，手心主郄……治心痛。”解剖学中，郄门穴处有正中神经的分支分布，其传入部分与颈5～胸1节断相连，经交感神经链的颈中、下神经节与心脏密切联系。根据经穴-脏腑相关理论，针刺郄门穴通过支配心脏的传出神经，影响心肌细胞的电活动和收缩功能，从而改善心功能，保护心肌细胞[6]。

心阻抗及其微分图是测定心脏动力学功能的有效方法之一[7]。本实验发现，模型组的众多指标如SV、SI、SWI、Ks、C、Vi、TPR 等较之正常组均明显异常(P ＜0.05或 P ＜0.01)，其中 SV、SI、SWI显著低于正常(均P＜0.05)，说明心脏缺血而损害了心脏动力学功能。TPR明显高于正常(P＜0.01)也是冠心病患者的典型特征，即压力负荷明显高于正常。C的降低、Vi的减少、Ks的升高反映了此类患者心脏动力学功能的降低;PEPI的延长、LVETI的缩短也反映了心功能的降低。针刺郄门穴或合谷穴后，许多异常的心脏动力学指标均获得明显改善，表1显示，郄门穴效果优于合谷组(P ＜0.01)[8]，从而表明针刺郄门穴能明显改善心肌缺血大鼠的心脏动力学功能。

NO生物学功能失调在心脏的生理病理过程中作用明显[9]，是近年来有关心肌缺血研究较多的重要分子之一。作为一种内皮细胞衍生舒张因子，NO可从内皮细胞弥散进入血管平滑肌细胞，并在胞内激活鸟苷酸环化酶，使三磷酸乌苷转化形成环磷乌苷，细胞内环磷乌苷升高可减少胞质钙离子，从而导致平滑肌舒张;另外，环磷乌苷的增加可抑制平滑肌细胞的迁移，因此具有显著而广泛的血管扩张和调节局部血流量的功能，可以使平滑肌松弛、抗血小板聚集、抑制平滑肌细胞增殖、抑制单核、巨噬细胞与内皮细胞黏附等，对心血管系统有显著的保护作用[10、11]。表 2显示，4组大鼠血浆 NO 含量比较，模型组较正常组明显降低(P＜0.01)，而针刺郄门组较模型组明显升高(P＜0.01)，且优于合谷组(P＜0.05)，而与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。本研究结果提示，针刺郄门穴可明显升高心肌缺血大鼠血浆NO含量，从而明显改善其心脏动力学指标，最终达到改善心肌缺血、保护心肌细胞的目的。

心肌缺血是心肌梗死基本的病理生理过程。大量的研究表明，在急性心肌梗死过程中心肌细胞不仅发生坏死，也可发生凋亡[12]。如图1中心电图结果所示，正常组大鼠心电图正常，模型、郄门和合谷组提示不同程度心肌缺血，模型组心肌缺血严重程度最大。Bcl-2与Bax是最早发现的细胞凋亡相关基因之一，而 Bcl-2是公认的抗凋亡基因，Bax是Bcl-2蛋白的拮抗因子，Bcl-2与 Bax在凋亡中形成抑制凋亡和促进凋亡的正负调控[13]。引起心肌细胞凋亡原因很多，心肌缺血、低氧、缺血/再灌注损伤、心脏过负荷、细胞内钙超载、自由基形成均可引起心肌细胞凋亡。为进一步探究针刺郄门穴对心肌缺血细胞的保护作用，本实验又对心肌缺血细胞的凋亡相关基因 Bcl-2与Bax蛋白表达进行了观察。实验结果显示，郄门组和合谷组在针刺治疗后大鼠心肌细胞中Bcl-2表达与模型组比较明显上调(P＜0.05)，而 Bax表达与模型组比较明显下调(P＜0.05)，Bcl-2与Bax比值与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，心肌缺血后，针刺郄门穴可抑制心肌细胞的凋亡，保护心肌细胞。

综合上述结果，联系经穴-脏腑相关理论，针刺郄门穴对心肌缺血大鼠心肌细胞的保护作用，其可能机制为针刺郄门穴通过调高血浆NO含量，来调节心脏的传出神经，影响心肌细胞的电活动和收缩功能，同时抑制其凋亡，从而达到改善心功能、保护心肌细胞的目的。

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