颈椎黄韧带叠压症兔黄韧带TGF－β1的表达＊

吴 彬 孟纯阳 王海滨 贾存岭 赵益峰 贾代良

（济宁医学院附属医院，山东 济宁272029）

颈椎病患者病因与颈椎间盘退变、关节突增生及黄韧带肥厚密切相关［1－2］，其中黄韧带肥厚在颈椎病的发病中起了重要的作用［3－4］。在此过程中，黄韧带发生了何种组织学改变及细胞因子的变化，文献鲜见报道。本文通过手术破坏新西兰大白兔颈5／6椎间稳定结构，引起后方黄韧带退变增生，在颈椎后伸时增生的黄韧带突入椎管，造成对脊髓的压迫，建立兔颈椎黄韧带叠压模型，观察黄韧带形态学、生物化学方面的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康3月龄新西兰大白兔48只，雌雄不限，普通级，质量（3000±250）g，合格证号：SCXK（鲁）20110013，由山东农业科学院畜牧兽医研究所提供。

1.1.2 主要试剂及仪器 胰蛋白酶购自美国Sigma公司，免疫组化TGF－β1试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 颈椎叠压症动物建模 48只新西兰大白兔随机分为2组，每组24只动物，模型组通过颈椎前路穿刺破坏纤维环及抽吸颈5／6髓核组织的办法建立黄韧带叠压动物模型。10%水合氯醛（300mg／kg）腹腔注射麻醉，动物取仰卧位，以颈5为中心取前路纵切口长约3cm，逐层切开，钝性分离，显露颈5／6椎间盘，针刺法破坏纤维环并抽吸髓核组织，彻底止血后缝合深筋膜及皮肤，术中注意观察呼吸、心率的变化，术后分笼喂养，肌注青霉素1周，4×105u／d，对照组动物不作处理。术后让动物自由活动颈部。

1.2.2 颈5／6黄韧带标本处理 建模后4、8、12周分别空气栓塞法处死对照组、模型组各8只动物，锋利刀片切取颈5／6黄韧带组织，置于4%多聚甲醛中固定24h，10%EDTA中脱钙72h，流水冲洗24h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋备用。石蜡包埋后进行连续切片备用，片厚5μm，进行苏木精－伊红染色，用日本奥林帕斯BX51显微镜进行观察，免疫组化法检测TGF－β1，一抗为TGF－β1抗体（武汉博士德生物工程有限公司），二抗为DAB显色剂ZLI－9032（北京中杉金桥生物技术有限公司），使用高温高压抗原修复，37℃温箱孵育2h，用DAB显色，阳性颗粒呈棕黄色。

1.3 统计学方法

所有数据均用±s表示，采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学处理。

2 结果

2.1 颈5／6黄韧带组织学变化

颈5／6黄韧带组织进行苏木精－伊红染色，对照组颈5／6黄韧带纤维环排列规则，细胞排列与分层的纤维环方向一致，纤维环的细胞呈梭形，其细胞核呈长茄形。模型组整个纤维环变得粗糙，排列紊乱，玻璃样变性及色素沉着，纤维环中可见圆形的纤维软骨细胞，纤维环之间形成裂隙，术后12周时最为明显，见图1。

2.2 颈5／6黄韧带TGF－β1表达的变化

用SABC免疫组织化学方法标记黄韧带中的TGF－β1，阳性颗粒呈棕褐色，定位于基质中，呈网束状。

模型制作后4、8、12周，模型组黄韧带TGF－β1的阳性染色面积较对照组明显增加，两组比较具有显著性学意义（P＜0.01）；术后8周及12周组黄韧带TGF－β1的阳性面积较术后4周组减少，两两比较无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表1。

图1 两组颈5／6黄韧带组织学变化

图2 两组颈5／6黄韧带TGF－β1的表达变化

表1 颈椎黄韧带叠压症C5／6黄韧带TGF－β1阳性表达面积（±s）

表1 颈椎黄韧带叠压症C5／6黄韧带TGF－β1阳性表达面积（±s）

分组 4周 8周 12周 F值P对照组模型组9.12±1.46 14.78±2.04 8.79±1.14 12.91±2.24 8.90±1.34 12.65±1.882.55＞0.05 6.37 4.63 4.62 P ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 t

3 讨论

黄韧带连接椎弓板，从上位椎弓板的下缘和内面，连至下位椎弓板的上缘和外面，参与围成椎管的后壁和后外侧壁。黄韧带退变后拉伸增厚，颈椎后伸时黄韧带形成皱褶，突入椎管，压迫脊髓，严重者可致瘫痪，毛宾尧称之为黄韧带叠压症［5］。临床上对其研究甚少，且文献鲜见报道。本文模拟人颈椎退变的过程，前路破坏椎间盘的稳定性、降低椎间高度，造成后方黄韧带拉伸、退变，增生、肥厚，颈椎后伸时突入椎管内压迫脊髓。在此过程中我们发现TGF－β1在模型制作的早期明显增加，而随着时间的延长，未再持续增加，而是稍有下降，可能为颈椎黄韧带退变的早期刺激TGF－β1的异常表达，而退变过程中，TGF－β1可能作为加速退变的因素仍持续表达。

颈椎的稳定平衡主要由2部分来维持，一是静力性平衡，包括椎体、椎弓及其突起、椎间盘和相连的韧带结构。二是动力性平衡，主要为颈部肌肉的调节与控制［6］。上述任何一个环节遭受破坏，均可能引起或诱发颈椎正常结构及平衡功能的丧失，从而导致颈椎不稳定，加速椎间盘及后方黄韧带的退变。本文通过颈椎前侧入路，针刺破坏了纤维环，并抽吸出髓核组织，使颈椎前方稳定性下降，同时椎间高度下降，导致颈椎后方稳定性受到影响，表现为黄韧带退变、增生、肥厚，后期黄韧带突向椎管，压迫脊髓，同时黄韧带本身的形态学发生改变。对照组正常黄韧带纤维排列规则，细胞排列与分层的纤维方向一致，纤维的细胞呈梭形，其细胞核呈长茄形。而模型组整个纤维变得粗糙，排列紊乱，玻璃样变性及色素沉着，纤维之间形成裂隙，术后12周时最为明显，并出现了纤维骨化的表现。

TGF－β1是一种调节细胞生长与分化的超家族分子，几乎参与了哺乳动物所有细胞的病理生理过程，尤其在细胞外基质的产生及调控方面意义重大［7－8］。正常情况下TGF－β1在颈椎黄韧带中少量表达，当黄韧带受到刺激后表达增加，本文证实了这一点。在我们制作的模型中，椎间高度降低，颈椎稳定受到影响，后方的黄韧带生物力学改变，受刺激后发生退变，出现增生、钙化、骨化。TGF－β1在黄韧带受到刺激的早期即出现大量表达，随着时间的变化，不是持续的增长，而是在保持高水平的过程中略有下降。TGF－β1表达增加可能为黄韧带退变的首要原因及促成因素。

脊柱稳定结构对维持脊柱的正常形态和生理功能意义重大［9－11］。本实验破坏了颈椎前方静力平衡结构，这种平衡的失调导致后方黄韧带的受力改变，从而导致了黄韧带退变、增生、突向椎管，形态学表现为黄韧带纤维层次结构不清，玻璃样变性，后期出现纤维骨化，在生物化学方面表现为黄韧带中TGF－β1表达增加。

综上，前方椎间高度的降低及稳定性改变会导致后方黄韧带退变、拉伸、突向椎管，形成黄韧带叠压，引起TGF－β1的表达增加，这可能是引起黄韧带退变的主要因素之一，但由于黄韧带退变的机制较为复杂，我们研究的时间较短，是否还有其他细胞因子的参与，需要进一步的研究。

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