miRNA-196b过表达对K562细胞增殖、凋亡及survivin、Cox-2表达的影响

尹虹 刘玥 郑文岭 宋艳斌 马文丽

南方医科大学基因工程研究所，广东 广州 510515

miRNA-196b过表达对K562细胞增殖、凋亡及survivin、Cox-2表达的影响

尹虹 刘玥 郑文岭 宋艳斌 马文丽*

南方医科大学基因工程研究所，广东 广州 510515

背景与目的：BCR-ABL融合基因是慢性粒细胞白血病发病的分子病理基础，也是诊断慢性粒细胞白血病、观察疗效、评估预后等的有效指标。miRNA-196b在急性粒细胞白血病中低表达并对疾病的发展起主要作用。在慢性粒细胞白血病中miRNA-196b的靶基因为BCR-ABL，miRNA-196b过表达抑制BCR-ABL融合基因的表达。生存素(survivin)是BCR-ABL的一个下游基因，已在多种肿瘤中发现survivin与环氧化酶-2(Cox-2)协同调节细胞的增殖凋亡。本研究旨在探讨miRNA-196b过表达对K562细胞增殖、凋亡及survivin、Cox-2 mRNA表达的影响。方法：实验分为K562-196b组、空载K562-pLV组与K562组，采用CCK-8法检测细胞增殖；采用AnnexinⅤ-PE检测细胞凋亡；采用实时荧光定量PCR法检测Cox-2、survivin mRNA的表达情况。结果：miRNA-196b过表达可以明显抑制K562细胞增殖；K562-196b组细胞凋亡率显著高于K562组(P＜0.05)；miRNA-196b组中survivin基因显著低表达(P＜0.05)，Cox-2基因中无明显变化(P＞0.05)。结论：miRNA-196b对K562细胞的增殖抑制和诱导凋亡有显著作用；miRNA-196b过表达可下调survivin基因的表达，为miRNA-196b作为慢性粒细胞性白血病的治疗靶点提供了依据。

miRNA-196b；K562细胞；细胞增殖；细胞凋亡

BCR-ABL融合基因所编码的具有络氨酸激酶活性的P210融合蛋白在慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)的发生中起着重要作用［1］，是研究治疗CML的关键所在。伊马替尼作为治疗CML的一线用药，其作用机制就是通过抑制BCR-ABL蛋白的自身磷酸化和底物磷酸化，使BCR-ABL阳性细胞的增生受到抑制或凋亡。但随着越来越多的耐药情况出现，需要寻找治疗CML的新方法或补充途径。

在我们之前的研究中，已经验证了miRNA-196b的靶基因为BCR-ABL，miRNA-196b过表达可下调BCR-ABL的表达。又有研究表明miRNA-196b在急性粒细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)中低表达［2］，并且对混合淋巴细胞型白血病的发展起重要作用［3］。因此，推测miRNA-196b在CML的治疗中也有着重要的意义。

生存素(survivin)和环氧化酶-2(Cox-2)这两种细胞因子均可抑制细胞凋亡，并在肿瘤的形成中发挥重要作用。Survivin作为BCR-ABL的一个下游基因，以survivin为分子靶点的联合治疗策略是近来CML治疗的研究热点。Cox-2不仅能够促进细胞黏附，抑制细胞凋亡的发生，促进肿瘤侵袭和转移，还发现Cox-2高表达与白血病进展及预后不良有密切关系。miRNA-196b过表达抑制BCR-ABL融合基因，是否对survivin、Cox-2 mRNA的表达也有影响，值得深入研究。本实验用慢病毒介导的miRNA-196b处理K562细胞，检测miRNA-196b对细胞增殖、凋亡的影响，以及Cox-2、survivin癌症因子表达的变化，从分子水平探讨针对BCR-ABL的CML的治疗。

1 材料和方法

1.1 菌株、细胞及其培养

K562细胞293T细胞和大肠杆菌DH5α为本实验室保存［4］。K562细胞接种于含体积分数10%的胎牛血清，青霉素、链霉素各100 U/mL的RPMI-1640培养液中，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱，饱和湿度下培养。每隔2～3 d换液传代。

1.2 主要试剂

慢病毒载体pLVTHM以及包装质粒均为本实验室保存［5］；CCK-8试剂盒购于日本同仁株社；AnnexinⅤ-PE细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；限制性内切酶、MMLV-RT反转录试剂盒、DNA连接酶、DNA聚合酶和转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和质粒提取试剂盒购自美国Promega公司；实验所用引物由上海英俊公司合成。

1.3 慢病毒介导的miRNA-196b稳定表达K562细胞株的构建

以人外周血淋巴细胞cDNA文库为模板，通过采用PCR扩增长度为284 bp 的pre-miR-196b扩增片段，PCR产物切胶回收后再进行MluⅠ和ClaⅠ双酶切，与载体pLVTHM连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在Amp抗性筛选平板上挑取单菌落，并培养鉴定。构建成功的重组载体命名为pLVTHM-miR-196b。重组质粒转染293T细胞制备慢病毒，病毒滴度测定后，将K562细胞接种到6孔板中，24 h后感染病毒，72 h用流式细胞仪分选GFP阳性的细胞，扩大培养，构建K562-196b稳定细胞株，同时设立空载体(pLVTHM)感染的K562细胞株为对照组，命名为K562-pLV细胞株。具体方法参照文献［5］。

1.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

细胞总RNA的提取过程参见文献［6］，逆转录参照invitrogen的M-MLV逆转录试剂盒操作进行逆转录，得到cDNA，进行下一步反应。按照ABI 7500 Real-time仪器说明书，每一样本和基因同时做3个复孔，输出数据为复孔Ct值的平均值，统计时采用2－ddCt进行比较。引物见表1。反应体系为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×) 10 μL，ROX 0.4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 6.8 μL。反应条件为95 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，45个循环；72 ℃ 30 s；融解曲线。

表 1 RT-qPCR所使用的引物Tab. 1 Primers used for RT-qPCR

1.7 Western blot检测BCR-ABL蛋白

裂解细胞，提取总蛋白，根据申能博彩BCA法测定蛋白浓度试剂盒对蛋白进行定量后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，以BCR-ABL和β-actin为一抗(1∶500稀释)，二抗为相应的辣根过氧化物酶标记的IgG，电泳分离、转膜、显影及照相参见文献［6］方法操作。图片结果应用WO-9413B型凝胶成像系统自带软件Gelpro32分析目的条带平均灰度及背景灰度，前者减去后者作为统计分析数值。最后统计取值为其灰度值与相应内参灰度值比值。

1.8 CCK-8法检测细胞生长曲线

实验分K562-196b组、K562-pLV组，K562组和空白对照组4组，每组设3个复孔。每组细胞以2×107/L的密度接种于96孔板，每孔100 μL，每2～3 d换1次液。每隔24 h加入CCK-8液体10 μL，3 h后在多功能酶标仪上测定吸光度A450值，共测量7 d，绘制生长曲线。A=As-Ab，其中As为实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8)，Ab为空白孔(不含细胞的培养基、CCK-8)。

1.9 Annexin V-PE检测细胞凋亡

实验设K562组为对照组，K562-196b组、K562-pLV组为处理组。细胞处理48 h后，收集细胞，PBS重悬细胞并计数，取5×104重悬细胞，1 000×g离心5 min，弃上清液，加入195 μL Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-PE，混匀后室温避光温育10 min，1 000×g离心5 min后收集细胞，弃上清液，将细胞重悬于0.5 mL 1×Binding Buffer，流式细胞仪进行检测。

1.7 统计学处理

应用SPSS 13.0版统计软件进行分析，采用ONEWAY ANOVA分析，并对各组之间数据进行两两比较(Scheffe法)。检验水准α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 pLVTHM-miR-196b重组载体的鉴定

pLVTHM-miR-196b重组载体转化DH5α菌后，在Amp抗性筛选平板上挑取单菌落进行培养，提取质粒后进行双酶切鉴定和测序鉴定。结果显示，两条条带分别为11 085 bp(pLVTHM片段)和284bp(pre-miR-196b扩增片段)。B为pLVTHM-miR-196b测序结果，阴影部分与数据库获得的pre-miR-196b 84 bp片段一致(图1)。

图 1 pre-miR-196b慢病毒表达载体pLVTHM-miR-196b的鉴定Fig. 1 Identification of the lentiviral expression vector pLVTHM-miR-196b

2.2 RT-qPCR验证感染病毒后miRNA-196b在K562细胞中表达增多

K562细胞转染慢病毒pLVTHM-miR-196b 48 h后收集细胞，提取总RNA，反转录得到第一链cDNA，并进行RT-qPCR反应，得到Ct值，采用2－ddCt表征各组之间miRNA-196b表达的倍数关系。其中U6为内参基因，K562组为对照组，K562-pLV为空载体组，hNC为正常人外周血有核细胞组。miRNA-196b的表达水平在K562-196b组中是K562组的10.32倍(P＜0.05)；hNC组是K562组的3.01倍(P＜0.05)；K562-196b组中miRNA-196b的表达水平高于hNC组，且差异有统计学意义(P＜0.05)；K562-pLV组与K562组差异无统计学意义(P＞0.05)。结果证明转染成功，miRNA-196b在K562-196b细胞稳定表达(图2)。

图 2 3组细胞miRNA-196b的相对定量结果Fig. 2 Relative expression of miRNA-196b in 3 groups

2.3 BCR-ABL融合基因在K562-196b组中表达降低

K562细胞转染慢病毒pLVTHM-miR-196b 48 h后收集细胞，分别提取总RNA和蛋白进行RT-qPCR和Western blot(图3)。β-Actin为内参基因，K562组为对照组，K562-pLV为空载体组。图3A为利用RT-qPCR通过计算2－ddCt得到BCR-ABL融合基因mRNA水平的相对表达量。K562组与K562-pLV组中BCR-ABL mRNA的表达基本一致；BCR-ABL mRNA在K562-196b组中表达低于对照组，约为对照组的0.5倍，差异具有统计学意义(P＜0.05)。图3B为Western blot检测BCR-ABL融合蛋白的表达，K562组、K562-196b组与K562-pLV组的灰度值比值分别为0.896 42、0.639 87和0.778 28，BCR-ABL融合蛋白在K562-196b组的表达低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。RT-qPCR检验结果与Western blot结果一致，证明BCR-ABL在K562-196b组中表达降低。

图 3 RT-qPCR和Western blot检测3组细胞中BCR-ABL mRNA及蛋白的表达Fig. 3 Expression of BCR-ABL mRNA and protein in three groups cells by RT-qPCR and Western blot, respectively

2.4 miRNA-196b过表达抑制K562细胞生长

每24 h向接种于96孔板的细胞悬液中加入CCK-8液体10 μL，37 ℃温育3 h后在多功能酶标仪上测定吸光度A450值，共测量7 d，绘制生长曲线(图4)。K562组与空载K562-pLV组细胞在第5、6天分别到达平台期，而K562-196b组细胞生长明显受到抑制且无平台期，证明miRNA-196b过表达对K562细胞生长有抑制作用。

2.5 miRNA-196b促进K562细胞凋亡

细胞培养48 h后收集3组细胞，按照AnnexinⅤ-PE细胞凋亡检测试剂盒说明书进行温育，经流式细胞仪检测，未经处理的K562细胞对照组、K562-pLV组与K562-196b组，细胞凋亡率分别为(4.37±0.44)%、(9.75±0.58)%、(21.42±1.08)%。K562-196b组细胞凋亡率均显著高于K562组(P＜0.05)，两两相比，K562-196b组细胞凋亡率显著高于K562-pLV组(P＜0.05)，K562-pLV组高于K562组(P＜0.05)。

图 4 3组细胞的生长曲线Fig. 4 The growth curve of the 3 groups of cells

2.6 RT-qPCR检测Cox-2、survivin的表达

3组细胞提取总RNA和逆转录同前，β-actin为内参基因，Cox-2、survivin为目的基因，通过计算2－ddCt得到目的基因mRNA水平的相对表达量。与对照组相比，Cox-2基因在K562-196b组中无明显变化(P＞0.05)，Survivin基因在K562-196b组中表达降低，差异有统计学意义(P＜0.05，图5)。

图 5 3组细胞中Cox-2、survivin的相对定量Fig. 5 The relative quantitaty of Cox-2 and survivin in 3 groups cells

3 讨 论

本研究发现，miRNA-196b过表达可以有效抑制K562细胞的生长，并诱导K562细胞的凋亡。这一结果提示miRNA-196b过表达对CML的治疗具有一定作用。但由于每个miRNA的靶基因一般不会只有1个，而每个靶基因又可能和多个miRNA相互作用，从而组成复杂的调控网络。为了更好地了解miRNA-196b对CML K562细胞的作用机制，我们选取了与肿瘤形成息息相关的survivin和Cox-2进行RT-qPCR检测。Survivin是人们最近发现的凋亡抑制蛋白家族的新成员［7］，是一种独特的细胞凋亡抑制剂，在肿瘤的形成中发挥重要作用［8］。Ibrahim等［9］的研究中，AML患者与健康人相比，survivin超标达36.7%，提示survivin对白血病的生成和预后有重要意义。Carter等［10］也提出survivin是治疗白血病的潜在重要靶点，且研究证明，survivin是BCR-ABL激活的信号中的一个下游基因，以survivin为分子靶点联合应用BCR-ABL阻断剂是治疗CML的良好策略。Cox-2通过上调抗凋亡蛋白bcl- 2 抑制细胞凋亡［11］，在恶性血液病的发生发展中有着重要作用。成志勇等［12］研究发现，CML患者慢性期及急变期细胞内Cox-2 mRNA表达明显高于正常对照，这一发现表明，Cox-2高表达与白血病进展及预后不良有密切关系。又有众多研究表明，在胃癌、肺癌、老年急性白血病等疾病中，survivin与Cox-2表达密切相关，发挥协同作用或survivin水平依赖于Cox-2的表达［13-15］。Guo等［16］的研究也发现Cox-2与survivin的表达密切相关，且核survivin低表达会促使肺鳞状细胞癌的抗凋亡和过度增殖，而Cox-2与细胞质survivin在肺鳞状细胞癌中的表达与低生存率、独立的预后标志以及潜在的治疗靶点相关。根据以上研究我们推测miRNA-196b过表达下调BCR-ABL融合基因，会导致survivin与 Cox-2表达下调。结合本实验RT-qPCR结果，我们发现miRNA-196b过表达可以下调survivin基因，却对Cox-2无影响，这与推测不符，进行如下分析。

Krysan等［14］证实的在非小细胞肺癌中survivin依赖Cox-2的调节，且survivin在Cox-2过表达细胞中稳定表达。Wang等［17］的研究确定了survivin是BCR-ABL信号通路的一个下游基因，且受到BCR-ABL融合基因的调控。BCR-ABL融合基因是miRNA-196b的靶基因之一，miRNA-196b过表达会下调BCR-ABL的表达，从而导致在miRNA-196b组中survivin基因含量显著低于对照组。然而，Cox-2的表达却没有如预期中协同survivin一同降低，而是与对照组基本一致，导致这一结果的原因，Li等［18］认为，miRNA-196b的其他靶基因，如HOXA9/MEIS1、FAS等基因的改变调控了Cox-2，使Cox-2的表达与K562组基本一致。

本研究通过miRNA-196b对CML K562细胞增殖和凋亡的影响，证明miRNA-196b可以抑制K562细胞的增殖并促进K562细胞的凋亡。通过比较K562-196b组与K562组中survivin和Cox-2表达水平的变化，发现miRNA-196b过表达可以下调survivin的表达，为miRNA-196b作为CML的治疗靶点提供了依据。

致谢：感谢广东省优秀人才引进项目对该研究的支持。

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Effects of miRNA-196b overexpression on proliferation, apoptosis and survivin, Cox-2 expression of K562 cells

YIN Hong, LIU Yue, ZHENG Wen-ling, SONG Yan-bin, MA Wen-li (Institute of Genetic Engineering, Southern Medical University, Guangzhou Guangdong 510515, China)

MA Wen-li E-mail: 339093503@qq.com

Background and purpose: BCR-ABL fusion gene is considered to be the molecular pathological basis and an effective indicator for diagnosis, observation, prognosis, and monitoring of chronic myelogenous leukemia (CML). MiRNA-196b had low expression in acute myeloid leukemia and played an important role in the development of disease. BCR-ABL is the target gene of miRNA-196b in CML, miRNA-196b overexpression leaded to BCR-ABL down-regulation or silencing. Survivin is a downstream gene of BCR-ABL signal pathways. Various studies had showed that survivin and Cox-2 cooperative regulated of cell proliferation and apoptosis in variety of tumors. The purpose of this study was to investigate the effects of miRNA-196b overexpression on proliferation, apoptosis and surviving, Cox-2 mRNA expression of K562 cells. Methods: Three groups including K562-196b, K562-pLV and K562 control groups were set up in this study. The cell proliferation and apoptosis were measured by CCK-8 assay and Annexin V-PE, respectively. The expression of Cox-2 and survivin genes at the mRNA level were detected by Q-PCR. Results: The proliferation of K562 cells could be significantly inhibited by miRNA-196b overexpression; Compared of the three groups of apoptosis rate, K562-196b group was significantly higher than K562 group (P＜0.05). The expression of survivin gene in miRNA-196b was donwregulated (P＜0.05), but the expression of Cox-2 gene in miRNA-196b group had no significant difference (P＞0.05). Conclusion: The miRNA-196b plays an important role in K562 cells proliferation inhibition and apoptosis; Overexpression of miRNA-196b can down-regulate survivin gene expression, and provide some basis for miRNA-196b as a therapeutic target for chronic myelogenous leukemia.

MiRNA-196b; K562 cells; Cell proliferation; Cell apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.05.004

R73-35

：A

：1007-3639(2013)05-0341-06

2012-12-18

2013-04-19）

广东省科技计划项目(No: 2012B031800135)；广东省自然基金项目(No: S2011020003140)。

马文丽 E-mail:339093503@qq.com