幽门螺杆菌CagV蛋白的克隆表达及初步分析

王艳冬，宫雅楠，肖 迪，张建中

幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，简称H.pylori）是一种微需氧的革兰氏阴性菌，为慢性活动性胃炎、消化性溃疡的主要病原菌，并与胃癌和胃粘膜相关性淋巴组织淋巴瘤的发生密切相关［1－2］，被列为I类致癌因子［3］。H.pylori的致病因子较多，其中主要毒力因子之一为细菌毒素相关基因（cytotoxin associated gene，cagA）所编码的蛋白CagA［4］，IV 型分泌系统（type IV secretion system，T4SS）是其转运装置。在H.pylori中，IV型分泌系统的作用主要是将相关毒素如CagA转运入胃上皮细胞中，诱导促炎症反应细胞因子如IL－8的合成和分泌等，从而引发一系列病理反应［5］。IV型分泌系统是由多个蛋白质分子组成的，其中CagV蛋白是其跨膜通道的组成部分，能够与其他多种组分进行相互作用，此外它在H.pylori菌株中高度保守，是一种潜在的药物靶点，目前国内外对其的研究报道较少。

有文献指出根瘤菌VirB系统是研究革兰氏阴性菌IV型分泌系统的原型，它由VirB1－11和VirD4 12个组分组成，这些组分在H.pylori中大多能够找到其序列相似物［6］，而VirB8作为一种重要的构成成分，没有找到与其序列相似的成分，且有研究表明CagV蛋白与VirB8在拓扑结构上具有相似性［6］。本研究拟对CagV蛋白进行克隆表达，并分析其结构和功能，旨在初步研究其特性，为幽门螺杆菌的诊治研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 H.pylori ATCC700392菌株及表达质粒pET28a为中国疾病预防控制中心传染病所诊断室（传染病预防控制国家重点实验室）保存；大肠杆菌BL21（DE3）、琼脂糖、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA Marker III购自天根生化科技有限公司；限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ、TaKaRa LA Taq酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；QIAamp DNA Mini kit购自QIAGEN公司；Histrap HP、Histrap SP、superdex 75购自 GE医疗。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 利用在线软件TMHMM2.0预测H.pylori CagV蛋白的跨膜区；利用在线软件PsiPred预测H.pylori CagV蛋白的二级结构。

1.2.2 目的基因的扩增 根据GenBank中H.pylori ATCC700392菌株cagV（hp0530）基因序列，运用Primer Premier 5.0软件设计相应基因的引物，并在5′端加入合适的内切酶位点。引物序列如 下： 上 游 引 物5′－CGCGGATCCATGTTGAAGAAAACGGATATATTTG－3′；下游引物5′－CGCCTCGAGTTATTTATTTAATGCCTTA

TTTTTTG－3′，分别插入Bam HI和Xho I的酶切位点（下划线处）。引物由上海生工公司合成。以H.pylori ATCC700392株基因组为模板，采用聚合酶链反应（PCR）扩增获得目的片段，扩增条件为：94℃ 预变性5min，94℃ 变性45s，55℃ 退火45s，72℃ 延伸90s，35个循环，72℃ 延伸5min。取50μL PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切胶进行琼脂糖凝胶DNA回收。

1.2.3 重组质粒的构建及鉴定 PCR切胶回收产物与表达载体pET28a同时进行Bam HI和Xho I双酶切，酶切产物以PCR产物与表达载体摩尔比6∶1的比例混合加入T4连接酶，16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，转化产物均匀涂布于卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜后挑取单菌落进行双酶切及测序鉴定。

1.2.4 重组蛋白的诱导表达 将鉴定为阳性的重组子cagV－pET28a接种到5mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃震动培养增菌至OD600值为0.6～0.8时加入终浓度为1mmol/L的异丙基－β－D－硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），37℃诱导表达4h。分别取1mL菌液至2支eppendorf管中，8 000r/min离心收集菌体，生理盐水清洗2次，各加入200μL生理盐水重悬菌体。其中1管菌液进行超声波处理后离心，分离上清和沉淀，沉淀中加入200μL生理盐水重悬。超声后上清、沉淀和全菌蛋白各取30μL后各加入10μL 4×蛋白上样缓冲液，沸水浴10min后进行1.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）分析。

1.2.5 飞行质谱蛋白鉴定 诱导表达产物经SDSPAGE后，在凝胶相应大小位置切下表达蛋白条带，按照飞行质谱样制备操作流程制备质谱样，然后经过4700MALDI－TOF－MS蛋白质组分析系统鉴定克隆表达蛋白的种类。

1.2.6 重组蛋白的纯化 将鉴定为阳性的重组子cagV－pET28a接种到5mL含卡那霉素的LB培养基中，37℃震动培养增菌至OD600值为0.6～0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃诱导表达4 h。离心收集菌体后重悬于A液（20mmol/L Tris溶液，50mmol/L NaCl溶液，40mmol/L 咪唑，pH 7.5），超声破碎细胞，12 000r/min离心20min收集上清。滤膜过滤后利用AKTA纯化仪纯化，首先用Histrap柱纯化，1－500mmol/L咪唑进行梯度洗脱。收集蛋白峰，脱盐后利用阳离子交换柱SP纯化，0－1mol/L NaCl溶液线性洗脱。浓缩样品，过Superdex 75柱，洗脱液为20mmol/L Tris溶液，50 mmol/L NaCl溶液，pH 8.0。每步纯化后样品均经过SDS－PAGE鉴定。

1.2.7 Western blot分析 重组蛋白SDS－PAGE后，准备好甲醇活化的PVDF膜，然后将凝胶、5层滤纸和PVDF膜置于转膜液中浸泡活化20min，至半干式电转印仪25V转膜60min；用含0.1%Tween20的Tris缓冲液（TBST）洗膜3次，每次10 min；转入封闭液（1×TBS＋0.5%脱脂奶粉＋0.05%的tween 20）中，1h，取出PVDF膜用TBST洗膜3次，每次10min；加入1∶100的一抗血清稀释液（幽门螺杆菌全菌蛋白免疫血清），37℃缓慢摇动孵育1h；取出PVDF膜用TBST洗膜3次，每次10min；加入1∶10 000的二抗反应液（辣根过氧化酶标记rSPA）37℃缓慢摇动孵育1h；洗膜后加入DAB（6mg DAB、10μL H2O2、1×TBS稀释至10 mL）摇床上缓慢摇动显色1min，然后用蒸馏水终止反应。

2 结 果

2.1 生物信息学分析结果 利用在线软件TMHMM2.0预测H.pylori CagV蛋白的跨膜区（图1），结果可以看出1－36位氨基酸为细胞质成分，37－59位氨基酸存在跨膜区，其余为周质区域。利用在线软件PsiPred预测H.pylori CagV蛋白的二级结构（图2），结果可以看出H.pylori CagV蛋白的跨膜螺旋随后为两个转角。

图1 CagV蛋白的跨膜区预测Fig.1 Prediction of the transmembrane region of the CagV protein

图2 CagV蛋白二级结构预测图谱Fig.2 Prediction map of secondary structure of the CagV protein

2.2 PCR扩增结果 PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳显示，得到片段大小与目的基因的大小507bp相符（图3）。

图3 PCR产物凝胶电泳分析Fig.3 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR product 1：The cagVof PCR product；2：DNA marker III

2.3 重组质粒双酶切鉴定结果 重组质粒双酶切后经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，检测到大小为507 bp和5 369bp（pET28a质粒大小）的片段，符合预期结果（图4），证明cagV－pET28a重组质粒构建成功。

图4 cagV－pET28a的双酶切鉴定结果Fig.4 Identification of recombinant plasmid cagV－pET28a by restriction enzymes

2.4 重组蛋白的诱导表达 重组菌株经诱导后进行1.5%SDS－PAGE，发现在24kD附近出现大量表达蛋白条带（His标签蛋白大小为6kD），与预计大小吻合，而未诱导菌无此条带（图5）。该蛋白条带经质谱鉴定结果为H.pylori CagV蛋白，其分子量约为18kD，其鉴定结果的可信度为100%。

图5 目的蛋白的诱导表达Fig.5 Expression product of the recombinant plasmid cagV－pET28a

2.5 重组蛋白的纯化及Western blot结果 纯化后的CagV蛋白（图6）作为抗原，以H.pylori全菌蛋白为阳性对照，大肠杆菌全菌蛋白为阴性对照，Western blot结果显示蛋白样品与H.pylori全菌蛋白在24kD左右有明显条带产生，而大肠杆菌全菌蛋白没有条带（图7）。

图6 CagV蛋白表达纯化结果Fig.6 Purified protein of expression product of CagV

图7 表达产物的Western blot结果Fig.7 Result of Western blot analysis

图8 CagV与VirB8蛋白预测拓扑结构比对Fig.8 Comparison of the predicted topology of the CagV and VirB8protein

3 讨 论

幽门螺杆菌T4SS是由cag致病岛编码的，其效应底物CagA是重要的致病因子。幽门螺杆菌T4SS由大约30几种组分构成，其中14种对CagA转运及IL－8诱导是必需的，而其余组分大多起辅助作用。根瘤菌VirB系统是研究T4SS的原型，在根瘤菌中包括12种T4SS机制组分（VirB1－VirB11，VirD4），这些组分在H.pylori中大多能够寻找到序列同源物，由此推测出H.pyloriT4SS组分按功能分为3类：供能组分、核心及辅助组分、菌毛相关蛋白。VirB8是T4SS中保守核心组分，它由N端细胞质片段、跨膜螺旋及C端周质片段组成。目前已经解析出根瘤菌（A.tumefaciens）和猪布氏杆菌（B.suis）的VirB8的周质结构域三维结构，均由4个β－sheet及5个α－螺旋组成。VirB8能够与VirB1，VirB4，VirB9，VirB10，VirB11进行相互作用，也能够与VirB6一起参与底物转运［7］，因此在T4SS组装及底物转运过程中起到核心作用。在H.pylori中，并未找到与VirB8序列相似的组分，根据预测的CagV蛋白的跨膜区和二级结构推测出H.pylori的CagV与VirB8的拓扑结构相似（图8），因此CagV可能是VirB8的同源物。

研究表明，CagV能够与多种T4SS组分相互作用，但对其结构和功能还不是很清楚，它是否是VirB8的同源物也没有得到证实。本研究成功表达了CagV蛋白的86－252片段，此外，Western blot实验结果表明CagV蛋白的86－252片段具有较好的抗原性，且序列比对结果显示它在H.pylori菌株中高度保守，因此是一种潜在的药物靶点，这对CagV结构和功能特性及与其它组分相互作用的进一步研究，对H.pylori致病机制探索以及药物设计都具有重要的意义。

［1］Figura N.IdentifiableHelicobacterpyloristrains or factors important in the development of duodenal ulcer disease［J］.Helicobacter，1997，2（Suppl 1）：S3－S12.

［2］Forman D.Helicobacterpylori：the gastric cancer problem［J］.Gut，1998，43（Suppl 1）：S33－S34.

［3］Murray CJ，Lopez AD.Alternative projections of mortality and disability by cause 1990－2020：Global Burden of Disease Study［J］.Lancet，1997，349（9064）：1498－1504.

［4］Asahi M，Azuma T，Ito Y，et al.HelicobacterpyloriCagA protein can be tyrosine phosphorylated in gastric epithelial cells［J］.J Exp Med，2000，191（4）：593－602.

［5］Terradot L，Waksman G.Architecture of theHelicobacterpyloriCag－type IV secretion system［J］.FEBS，2011，278：1213－1222.

［6］Buhrdorf R，Cornelia F，Haas R，et al.Topological analysis of a putativevirB8homologue essential for thecagtype IV secretion systeminHelicobacterpylori［J］.Int J Med Microbiol，2003，293：213－217.

［7］Baron C.VirB8：a conserved type IV secretion system assembly factor and drug target［J］.J Cell Biol，2006，84：890－899.