3种中药注射剂无菌检查方法的建立和结果评价

江志杰 高春

注射剂是当代常用的剂型之一，它在治疗常见病、多发病及急重症的抢救上发挥了独特的作用［1］。而中药注射剂作为中药制剂的新剂型，已广泛应用于临床。舒血宁注射液系银杏叶经提取制成的灭菌水溶液，其有效成分主要是黄酮苷类和萜类内酯活性物质，临床用于治疗心脑血管疾患［2］。穿心莲注射液是由穿心莲药材经加工制成的注射液。主要用于咽喉肿痛，肺热咳嗽，热痢，亦可用于上呼道感染，细菌性痢疾等［3］。银杏叶提取物注射液属心脑血管扩张药，主要用于脑部、周边和冠状血流循环障碍。而中药注射剂的不良事件的发生，引起大家的强烈关注，比如双黄连事件、刺五加事件等，但中药注射剂不良反应的主要原因有两方面，首先是药物本身问题，质量不合要求，是发生严重不良反应的根本原因［4］。本实验三个品种剂型均属注射剂类，为确保临床用药安全，《中国药典(一部)》2010年版［5］规定需进行无菌检查，为确保无菌检查方法的科学性和检验结果的准确可靠，药典明确规定对所用的无菌检查法必须经过验证，才能确保检验结果的准确可靠［6］。本实验旨在按药典要求对舒血宁注射液、穿心莲注射液和银杏叶提取物注射液进行无菌方法学验证，按建立无菌检查方法，对其进行检验，考察市场上三种中药注射剂能否达到无菌要求。

1 试验材料

1.1 验证菌种 金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26 003］、大肠埃希菌［CMCC(B)44 102］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63 501］、生孢梭菌［CMCC(B)64 941］、白色念珠菌［CMCC(F)98 001］、黑曲霉［CMCC(F)98 003］均购自中国食品药品检定研究院。

1.2 培养基及冲洗液 硫乙醇酸盐流体培养基，改良马丁培养基，营养肉汤培养基，改良马丁琼脂培养基，营养琼脂培养基，0.1%蛋白胨水溶液，均按照《中国药典》2010年版二部附录ⅪH无菌检查法项下要求配制。

1.3 样品 本试验所用样品，舒血宁注射液来自8个生产企业159批次，穿心莲注射液来自5个生产企业107批次，银杏叶提取物注射液来自1个生产企业158批次，见表1。

表1 三种中药注射剂的品名、生产厂家、规格和批次

1.4 仪器和滤器 HTY无菌隔离器、HTY22000A集菌仪和一次性使用的全封闭三联集菌培养器(杭州泰林生物技术设备有限公司)，生化培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，生物安全柜(力康生物医疗科技控股有限公司)。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 按照《中国药典》2010年版一部附录Ⅺ H无菌检查法［5］项下对照菌液配制，最终制备的菌液浓度每1 ml含10～100个菌(cfu)，同时进行平板计数，计数结果见表2。

表2 菌落计数结果(cfu/ml)

2.2 样品的取样量 3种中药注射剂均为液体制剂，规格为2 ml或5 ml，根据2010年版中国药典无菌检查法的有关要求，一次试验中一组三联集菌培养器(其中1个滤筒检查细菌、1个滤筒检查真菌、另1个滤筒作为阳性对照)需要的样品量最少应为30支。过滤样品溶液前，先经少量0.1%蛋白胨水溶液润湿滤器、排空，再进行样品溶液的过滤。

2.3 中药制剂的抑菌性的初步考察 采用直接接种法，最少的培养基的量(硫乙醇酸盐流体培养基15 ml和改良马丁培养基10 ml)，样品接种量为 1 ml，加入阳性菌(10～100cfu)，培养16 h后，结果发现，与阳性菌对照(用0.1%蛋白胨水溶液代替样品)相比，舒血宁注射液的金黄色葡萄球菌长的菌柱数或是其长度要差很多，其余试验菌株相差不明显，说明舒血宁注射液对金黄色葡萄球菌有微弱的抑菌作用，而穿心莲注射液和银杏叶提取物注射液的所有菌株与阳性对照组相比几乎没有差异，说明它们对试验菌株没有抑菌作用或抑菌作用可以忽略不计，但它们本身带一定的颜色，结合药典附录要求首选薄膜过滤法，用0.1%无菌蛋白胨水溶液冲洗1次，去除样品本身的颜色或可能存在的抑菌作用。

2.4 中药注射剂的无菌检查方法学验证 采用薄膜过滤法，取一次性全封闭集菌培养器(三联)，先用冲洗液(0.1%无菌蛋白胨水溶液)润湿滤膜，取规定量的供试液全部通过3个滤器，滤干后用冲洗液冲洗一次，每次每膜100 ml，过滤后2个滤筒加入硫乙醇酸盐流体培养基各100 ml，另1个滤筒加改良马丁培养基100 ml，平行两份，分别加入上述6种验证菌株(10～100cfu)，作为试验组;另取一装有同体积相同培养基的滤筒，加入等量试验菌，作为阳性对照组，硫乙醇酸盐流体培养基的滤筒置33℃培养，改良马丁培养基置25℃培养，观察验证菌生长情况，结果见表3。

表3 中药注射剂采用薄膜过滤法的验证结果

由表3中的结果可以发现，样品本身和阴性对照组均无菌生长，试验组各滤筒中试验菌与阳性对照组比较均生长良好，说明三种中药注射剂的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，上述检查方法可行。

2.5 三种中药注射剂的无菌检验结果 根据药典要求，中药注射剂必须达到无菌要求，采用验证后的无菌检查方法，对表1中所有来自8个生产企业159批次的舒血宁注射液，来自5个生产企业107批次的穿心莲注射液和来自1个生产企业158批次的银杏叶提取物注射液进行无菌检查试验，结果供试品筒均澄清，阳性对照均生长良好，判定中药注射剂无菌检查均符合规定。

3 讨论

3.1 三种中药注射剂无菌检查方法的确定 取供试品，用封闭式薄膜过滤器全部过滤，以0.1%无菌蛋白胨水溶液为冲洗液，冲洗1次，每筒100 ml，以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌，依法检查(中国药典2010年版一部附录ⅩⅢB薄膜过滤法)。

3.2 试验小结，无菌试验必须注重试验操作细节，比如试验过程中不能让针头在外面暴露的时间太长，也不能让样品本身接触安瓿瓶断截面，容易导致人为污染等;检验结果显示，所有来自14个生产企业424批次的中药注射剂无菌检查结果均符合规定。

［1］BAI X J.An objective view of traditional Chinese medicine injection.Journal of Traditional Chinese medicine(中医杂志)，2009，50(9):842-843.

［2］封淑华，冯丽，赵志军，等.舒血宁注射液生产工艺探讨.中国中药杂志，2010，35(14):1909-1910.

［3］袁梦哲，李绍峰.穿心莲注射液含量测定方法的改进.数理医药学杂志，2010，23(5):617-618.

［4］李贻奎，张金艳.中药注射剂的改进与提高.中国中药杂志，2011，36(14):1905-1909.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部).北京:中国医药科技出版社，2010.

［6］赵亚丽，吴 英.双黄连注射液无菌检查的方法验证.黑龙江医药，2011，24(1):31-32.