一种吡虫啉的酶联免疫快速检测试剂盒的研制

马寅生 冯才伟 贾芳芳 冯 静 杨 烁

（北京勤邦生物技术有限公司 北京 昌平 102206）

一种吡虫啉的酶联免疫快速检测试剂盒的研制

马寅生 冯才伟 贾芳芳 冯 静 杨 烁

（北京勤邦生物技术有限公司 北京 昌平 102206）

本文利用酶联免疫技术研制了一种快速检测吡虫啉残留的试剂盒，经过测试，该试剂盒对蔬菜、水果样本的检测限为20μg/kg，批内、批间相对标准偏差均小于10%。本研究的吡虫啉ELISA检测试剂盒能够应用于大量样品的现场检测，使用简便，结果准确、可靠。

吡虫啉 酶联免疫试剂盒 蔬菜 水果 快速检测

吡虫啉(IMI)是烟碱类杀虫剂，具有广谱、高效，害虫不易产生抗性，对人、畜、植物和天敌安全等特点，主要用于防治刺吸式口器害虫及其抗性品系[1,2]。目前，含IMI的农药产品已在120多个国家的140余种农作物上登记使用，应用范围涉及粮食、经济、果树、茶叶和蔬菜等[3]。然而，IMI的大量使用对环境造成了严重影响，同时畜禽因长期食用含IMI残留的植物，使其在体内富集，最后经食物链进入人体，危害人体健康。

从文献报道看，有关吡虫啉残留的检测方法主要集中于高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、电化学分析法(EA)和免疫分析法(ELISA)4个方面。通过比较仪器法和快检方法在我国实际检测中所起到的作用，本研究着重建立一种检测蔬菜、水果样本中吡虫啉的酶联免疫吸附法，该方法的准确性高于一般的快速检测方法，检测程序及所需条件较仪器法更方便，尤其便于现场大量样本的检测，更适于中小企业对成本控制的需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

吡虫啉标准品购自北京标准物质研究中心，二甲基甲酰胺、牛血清白蛋白、碳酸盐、戊二醛、卵清蛋白、硼氢化钠等均购自北京百欣试剂公司，蔬菜、水果购自超市，酶标仪购自上海雷勃分析仪器有限公司，涡旋仪、均质器购自湖南湘立科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 吡虫啉半抗原的制备 100ml二口瓶中加入吡虫啉0.25g，二甲基甲酰胺(DMF)1ml，水合氯化锡0.75g和乙醇10ml，氮气排空，控温65℃反应40min，反应液显褐色，薄层色谱(TLC)检测反应完全。处理：降温至室温，加乙酸乙酯50ml，加饱和碳酸氢钠水溶液调节至弱碱性，大量盐析出，乙酸乙酯40ml×2次萃取浑浊液，合并有机相，盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，蒸干溶剂，得固体产物0.22g。

图1 吡虫啉半抗原合成路线图

1.2.2 抗原的制备 （1）免疫原制备—吡虫啉半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到免疫原。取7mg半抗原，溶解于1ml DMF中；取0.1ml戊二醛水溶液加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取牛血清白蛋白(BSA)30mg，使之充分溶解在2.7ml 0.1mol/L碳酸盐缓冲液(CB)(pH 9.6)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.2ml 5mol/L的硼氢化钠水溶液还原反应4g，用0.01mol/L磷酸缓冲液(PBS) 4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。（2）包被原制备—吡虫啉半抗原与卵清蛋白(OVA)偶联得到免疫原。取7mg半抗原溶解于1ml DMF中；取0.1ml戊二醛水溶液加入半抗原溶液中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A；称取OVA 30mg，使之充分溶解在2.7ml 0.1mol/L CB(pH9.6)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.2ml 5mol/L的硼氢化钠水溶液还原反应4h，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d，每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。

1.2.3 酶标板的制备 吡虫啉单克隆抗体及羊抗鼠抗抗体制备完成后，进行酶标板的制备。用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育2h，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

1.2.4 试剂盒灵敏度和检测限试验 以标准曲线0浓度标准溶液吸光度值50%处所对应的药物浓度(IC50)来评价试剂盒的灵敏度。分别对20份蔬菜、水果空白样品进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限。

1.2.5 样本精密度和准确度试验 以回收率作为准确度评价指标，重复测定某一浓度样品的检测结果相对标准偏差(RSD%)作为精密度评价指标。计算公式为：回收率(%)＝实际测定值/理论值×100%，其中理论值为样品的添加浓度；相对标准偏差RSD%＝SD/X×100%，其中SD为标准偏差，X为测定数据的平均值。按100µg/kg、300µg/kg、500µg/kg三个浓度吡虫啉分别对蔬菜和水果样品进行添加回收测定，每个样品做4个平行，用三批不同试剂进行测定，计算样品的平均回收率及精密度。

2 结果与分析

2.1 半抗原合成鉴定结果

用核磁共振氢谱测定制备好的吡虫啉半抗原，如图2所示，4.7ppm左右的峰为咪唑啉环上的两个亚甲基信号峰，5.0ppm左右的峰为苄基信号峰，7.2-8.7ppm为氨基与芳环混合信号峰，说明目标半抗原合成成功。

图2 吡虫啉半抗原核磁共振氢谱图

2.2 试剂盒灵敏度和检测限

按照常规方法测定试剂盒灵敏度，试剂盒标准曲线最低点为4μg/kg，标准曲线的范围为4～324μg/kg，IC50(50%抑制浓度)为12.9μg/kg；对20份样品进行检测，从标准曲线上查出对应于各百分吸光度值的浓度，以20份样本浓度的平均值加上3倍标准差表示检测限，结果得该方法对样本的检测限为20μg/kg。见图3。

图3 吡虫啉标准曲线图

2.3 样本精密度和准确度试验

以100、300、500µg/kg三个浓度的吡虫啉分别对蔬菜和水果样品进行添加，平均回收率在83.5%～117.9%之间；批内、批间的相对标准偏差均小于10%。见表1、2。

表1 蔬菜精密度及准确度试验 (μg/kg、%)

表2 水果精密度及准确度试验 (μg/kg、%)

3 讨论

目前，高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、电化学分析法(EA)和免疫分析法(ELISA)是检测吡虫啉残留的主要方法。Placke and Weber曾经报道了运用HPLCUVD研究了IMI在植物中的残留量[4]。IshiiY等也采用HPLC-UVD检测技术研究了IMI在部分作物和土壤中的残留动态[5]。Fermandz Alba A R等用HPLC-DAD测定蔬菜中IMI残留量[6]。Erenchun N R等还采用HPLC-PRAD测定了土壤中的残留IMI及其主要降解物含量[7]。Fernadez Alba A R等应用HPLC-MS技术检测蔬菜中IMI残留量，得到了小于1.0 mg/kg的检出限[8]。有关IMI残留GC测定方法主要集中在GC-MS联用技术上，如NavalonA.等运用GC-MS测定蔬菜中IMI的残留量，得到了1.25～25mg/kg的线性检测范围和2.5mg/kg的检测限[9]。IMI残留的电化学分析方法报道较少，且其线性检测范围，检测限均不及色谱法。在IMI残留的免疫检测方法方面，Jae Koo Lee等报道了通过制备IMI-pAb，采用间接竞争ELISA检测苹果和水中的IMI残留，其检测限为5.0µg/L[10]。Zhixiong Li等报道了基于抗IMI多克隆抗体(IMI-pAb)的间接竞争ELISA，检测限是30ng/ml[11]。国内，郑尊涛等报道了IMI的间接竞争ELISA检测方法，最低检测限为1.2μg/L，该研究的下一步计划是研发试剂盒[12]。朱国念等在2005年制备了吡虫啉多克隆抗体，利用酶联免疫反应测定其检测限为1.1 µg/L[13]。本研究的吡虫啉ELISA快速检测试剂盒比起高效液相色谱法、气相色谱法以及电化学分析法更为简便；该试剂盒对蔬菜、水果样本的检测限为20μg/kg，虽然比起上述文献中的同类方法较高，但是此类文献并未开发出试剂盒，实际应用性有待加强；同时该试剂盒的操作时间仅需1.5h，即具有更适宜现场快速检测的优点。

目前，色谱法是公认的药物残留检测方法，但这类方法普遍存在着所需仪器昂贵、操作技术要求高、样品前处理繁琐和分析耗时长、检测成本高、不适于现场实时检测等问题。而药物残留免疫检测技术在残留样本检测过程中的复杂程度、速度、灵敏度、准确性、特异性、单位时间内样本分析容量、检测成本等方面与仪器分析法的比较优势突出，几乎克服了仪器分析法所表现出来的所有不足，近年来已经在食品质量安全检测中得到了越来越广泛的应用，逐渐被人们认可。

今天，人们对农产品安全呼声日益提高，农产品中农药残留的有效检测手段致关重要。国际上对农产品中吡虫啉最大残留量的规定日益严格，为更好地适应进出口贸易和保护人民的健康，开发农产品中IMI的残留快速检测技术势在必行。免疫学方法是当前药物残留检测的研究热点。如何使残留样本前处理程序更加简单、灵敏度更高、成本更低廉，是摆在我们面前亟待解决的重要问题。

[1] 剧晓青. 吡虫啉在茶叶和土壤中的降解动态研究[D]. 重庆: 西南大学, 2006: 15.

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[3] 李广领. 吡虫啉残留免疫学快速检测技术研究[D]. 河南科技学院, 2010: 1.

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