老年和青年豚鼠喉部水通道蛋白1～5表达的研究

李翠娥 陶泽璋 周涛 詹娜 史艳莉

老年和青年豚鼠喉部水通道蛋白1～5表达的研究

李翠娥1陶泽璋1周涛1詹娜2史艳莉3

目的探讨青年和老年豚鼠喉部水通道蛋白1～5（aquqporin，AQP1～5）的表达及意义。方法 选取健康4月龄豚鼠（青年组）和2年龄豚鼠（老年组）各10只，用免疫组织化学染色法观察两组豚鼠喉部组织AQP1～5的表达，用Image-Pro Plus 6.0 For Window图像分析软件处理，比较两组结果。结果 两组豚鼠喉部组织均有AQP1～5表达，AQP1主要表达在喉黏膜假复层纤毛柱状上皮、固有层的腺体以及小血管内皮细胞；AQP2主要表达于黏膜固有层的粘液性腺体和炎性浸润细胞，黏膜上皮细胞无或弱表达；AQP3高表达于黏膜假复层纤毛柱状上皮，腺体、血管内皮细胞和肌纤维组织均无表达；AQP4主要表达于喉黏膜鳞状上皮、假复层柱状纤毛上皮、固有层黏膜腺体、肌纤维及部分浸润细胞，血管内皮细胞无表达；AQP5主要表达于喉黏膜假复层纤毛柱状上皮细胞、上皮基底细胞、黏膜下浆液性腺体及导管，粘液性腺体无表达。青年组喉部AQP1、4的表达高于老年组，AQP5的表达低于老年组（P＜0.05），两组间AQP2、3的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 豚鼠喉部组织有AQP1～5表达，老年豚鼠AQP1、4表达降低、AQP5表达升高的变化可能与其喉部老化改变有关。

豚鼠； 喉； 水通道蛋白； 衰老

自从1992年第一个水通道蛋白（aquqporin，AQP）AQP1的分子特性被报道以来，又发现了很多其他的AQPs，在人类，至少已发现了水通道蛋白大家族的13个成员。很多哺乳动物的AQPs，包括AQP1、AQP2、AQP4、AQP5和AQP8，其功能首先是作为双向选择性水转运子，与胞膜上无AQPs表达的细胞相比较，胞膜上有AQPs表达细胞的透水性要高5～50倍［1］。AQPs在上皮液体转运和水合作用、神经信号转导、细胞迁移、细胞增殖以及脂肪代谢中有重要功能，同时还参与了许多器官（如脑、心、肺等）水肿和肿瘤的发生发展过程［2，3］。AQP3、AQP7和AQP9还可以转运甘油［4，5］，目前的证据表明，哺乳动物AQPs的大多数生物功能都可归因于AQPs促进水和／或甘油的转运［2］。

AQPs在哺乳动物喉部有不同程度的表达［6～11］，其在喉部表达及调节的意义尚未明了。既往研究发现AQP1在喉癌组织毛细血管内皮细胞中的表达较正常组织明显增多，推测其通过增加喉癌组织上皮和血管对水的通透性，促进肿瘤组织的血管生成，从而促进肿瘤的生长和转移［12］。目前国内尚未见老年豚鼠喉部水通道蛋白表达的研究，因此，本研究拟通过观察AQP1～5在青年和老年豚鼠喉部的表达，探讨其生物学意义及其在喉部衰老中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取健康4月龄豚鼠10只作为对照组（青年组），体重300～550 g，自然衰老的2年龄豚鼠10只作为老年组［13，14］（由四川泸州医学院实验动物中心提供），体重600～900 g，雌雄不分。

1.2 动物取材及免疫组化染色 本实验使用的是美国GBI公司推出的两步法抗兔／鼠通用型免疫组化试剂盒（PV-9000），其试剂一：Polymer Helper（即用型），试剂二：Polyperoxidase-anti-mous／rabbit IgG（即用型），染色步骤按产品说明书操作。

动物用10%的水合氯醛按350 mg／kg剂量腹腔注射麻醉后，断头处死，快速取出喉部，4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，沿喉的纵轴连续切片，片厚5μm。石蜡切片65度烤片90分钟。二甲苯1脱蜡10分钟，二甲苯2脱蜡10分钟。梯度酒精依次脱水2分钟；PBS洗2分钟二次。柠檬酸缓冲液微波修复，p H＝6.0。室温冷却，PBS洗3次；现配3%H2O2封闭，以阻断内源性过氧化物酶。PBS洗3次，甩去PBS液，第一抗体按建议浓度稀释。每张切片加入50μl稀释液，4℃过夜。PBS冲洗3次，甩去PBS液，每张切片加50～100μl一抗（试剂一，PV-9000第一抗体），37℃孵育20分钟。PBS冲洗3次，甩去PBS液，每张切片加50～100μl二抗（试剂二，PV-9000第二抗体），37℃孵育20分钟。甩去PBS液，每张切片加50～100μl新鲜配制的DAB显色液，室温下孵育，显微镜控制显色，显色完全后，蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗返蓝。切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜下观察。以PBS代替一抗做阴性对照。AQP1～5的阳性染色为细胞膜和细胞质中出现棕黄色颗粒，颜色越深，表达越强。

1.3 统计学方法 图像用Image-Pro Plus 6.0 For Window（IPP6.0）（Media Cybernetics公司）图像分析软件处理，取各图片的平均值作为灰度值，数值越大表达越强，两组间AQP1～5的表达差异显著性检验采用多因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AQP1的表达 AQP1主要在喉黏膜假复层纤毛柱状上皮、固有层的腺体（包括浆液性和粘液性腺体）以及小血管内皮细胞中表达，青年组表达强度明显高于老年组，老年组未见明显表达（图1）。

2.2 AQP2的表达 AQP2主要表达于黏膜固有层的粘液性腺体和炎性浸润细胞，黏膜上皮细胞无或弱表达，青年组和老年组豚鼠喉部AQP2的表达强度无明显差异（图2）。

2.3 AQP3的表达 AQP3高表达于喉黏膜假复层纤毛柱状上皮，腺体、血管内皮细胞和肌纤维组织均无表达，两组间AQP3的表达强度无明显差异（图3）。

2.4 AQP4的表达 AQP4主要表达于喉黏膜鳞状上皮、假复层柱状纤毛上皮、固有层黏膜腺体、肌纤维及部分浸润细胞，血管内皮细胞无表达，青年组AQP4的表达强度高于老年组，老年组喉部AQP4无表达或弱表达（图4）。

2.5 AQP5的表达 AQP5主要表达于喉黏膜假复层纤毛柱状上皮细胞、上皮基底细胞、黏膜下浆液性腺体及导管，粘液性腺体无表达，青年组AQP5的表达强度低于老年组（图5）。

2.6 AQP1～5表达的灰度值比较 两组豚鼠喉部AQP1～5表达的灰度值见表1，可见青年组AQP1、4的表达高于老年组，AQP5的表达低于老年组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 青年组和老年组喉部AQP1～5表达灰度值比较

3 讨论

声带的表面液体对维持声带黏膜的最佳生物力学性能非常重要，可保持声带润滑、增加声带振动的效能，以改善嗓音质量［15］，AQPs对喉部腺体的正常分泌有重要作用，腺体的正常分泌不仅对声带润滑非常重要，还通过分泌的免疫球蛋白对黏膜的防疫系统起作用。AQPs可促进快速和高选择性的水转运，以调节细胞体积和渗透梯度［7，11］，故调节AQPs可以控制声带边缘的轮廓，改善声带的振动，对发声生理如发声域压很重要［7］。

图1 两组豚鼠声带AQP1的表达 （a对照组，b老年组，红色、蓝色箭头分别表示AQP1在上皮、腺体的表达）（×400）

图3 两组豚鼠声带AQP3的表达 （a对照组，b老年组）（×400）

图5 两组豚鼠声带AQP5的表达 （a对照组，b老年组）（×400）

图2 两组豚鼠声带黏膜下腺体AQP2的表达 （a对照组，b老年组）（×400）

图4 两组豚鼠声带AQP4的表达 （a～c为青年组，分别为AQP4上皮、腺体和肌纤维中AQP4表达；d～f为老年组，分别为喉的上皮、腺体和肌纤维中AQP4的表达）（×400）

Song等［10］发现小鼠鼻咽部和上呼吸道黏膜下腺浆液性腺上皮细胞的基底侧膜和内膜面有AQP4和AQP5表达，并且证实AQP5对喉部黏膜下腺体的分泌有重要作用。关兵等［6］发现，AQP1主要表达于大鼠喉黏膜固有层的血管内皮细胞、喉黏膜腺体及肌细胞核膜上，AQP4主要表达于大鼠喉黏膜鳞状上皮、假复层柱状纤毛上皮、固有层黏膜腺体及肌细胞膜上。Lodewyck等［7］用免疫电镜技术检测了AQPs在绵羊喉部的表达，发现AQP1和AQP2在绵羊声带上皮细胞的质膜区有表达，而AQP3在声带的表达不能确定，可能与检测方法有关。Ahmed等［11］研究发现，AQP1、4、5在C57BL／6J小鼠喉部上皮包括声带有表达，AQP2、3、5、6、7、8表达于喉黏膜下的腺体。不同的AQP在喉部的具体表达部位不同，构成了一个水通道蛋白的网络，协同完成对空气的加湿作用，并精确控制腺体的分泌；同一组织中有多种AQP分布，可以保证细胞便捷地与周围环境进行水分的吸收与分泌，从而维持细胞正常的代谢功能。

本研究发现，豚鼠喉部有AQP1～5分布，其中AQP3只在上皮表达，AQP2只在腺体表达，AQP1、4、5在上皮和腺体都有表达，AQP1还在小血管内皮细胞有表达。AQP1在血管内皮细胞中表达，能使水迅速通过毛细血管内皮细胞进入胞外组织液中，调控细胞间的液体量和血管的流体静压和胶体膨胀压，以满足喉部组织细胞的代谢需要；AQP1、3、4、5在上皮的表达说明其通过经上皮的水转运在调节声带表面的液体平衡中起关键作用［11］；AQP1、2、4、5在腺体的表达有利于腺体分泌。可见，喉部组织中存在多种AQPs表达，可使细胞消耗较少能量进行水分的吸收与分泌，保持喉粘液的正常分泌和黏膜表面湿度，促进纤毛运动，对维持喉部正常生理功能有重要作用。

老年哺乳动物AQPs的表达呈现出年龄相关性变化。Preisser等［16］发现在WAG／Rij大鼠肾脏，从10月龄到30月龄，AQP1和AQP4的表达无明显变化，而AQP2和AQP3的表达分别下降了80%和50%；而Combet［17］却发现，老年WAG／Rij大鼠肾脏AQP2表达下调，AQP3表达却上升。Zhang等［18］发现，与8～10周龄小鼠相比较，20～24月龄小鼠肺部AQP1和AQP5的mRNA的表达分别下调了55.5%和50.3%，AQP1和AQP5蛋白的表达也分别下调了36.9%和44.6%；Ahmed等［11］也发现，老年小鼠喉部腺体组织中AQPs的表达下降。从本研究结果看，与青年组豚鼠比较，老年组豚鼠喉部AQP1、4的表达明显降低，AQP5的表达明显增高，说明AQP1、4、5可能参与了豚鼠喉部的老化过程，但其具体机制还需进一步研究。老年豚鼠喉部AQP1、4、5表达的变化可能通过经上皮的水转运和黏膜下腺体的分泌影响声带表面的液体平衡，进一步影响声带黏膜的生物力学性能，从而导致嗓音发生年龄相关性改变。本研究观察到青年组与老年组豚鼠喉部AQP2、3的表达无明显差异，提示AQP2、3与豚鼠喉部的老化过程可能无关，但本研究样本量较少，还有待今后进一步观察。另外，本研究结果显示AQP1～5在喉部的具体表达部位有些与其他研究不同，可能与动物品种和实验方法不同有关，但这些均需要进一步研究证实。

（致谢：感谢四川泸州医学院附属医院耳鼻咽喉科的殷泽登教授对本实验的帮助与支持！）

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17 Combet S，Ceffroy N，Berthonaud V，et al.Correction of age-related polyuria by d DAVP molecular analysis of aquaporins and urea transporters［J］.Am J Physiol Renal Physil，2003，284：F199.

18 Zhang YW，Bi LT，Hou SP，et al.Reduced lung water transport rate associated with downregulation of aquaporin-1 and aquaporin-5 in aged mice［J］.Clin Exp Pharmacol Physiol，2009，36：734.

（2013-03-12收稿）

（本文编辑 雷培香）

The Expression of AQP1～5 in the Larynx of Young and Old Guinea Pig

Li Cuie，Tao Zezhang，Zhou Tao，Zhan Na，Shi Yanli
（Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan，430060，China）

Objective To study the expression of aquaporin（AQP）1～5 in the larynx of young and old guinea pig.Methods Ten young（4 months old）guinea pigs and 10 old（2 years old）guinea pigs were included in this study.The expression of AQP1～5 in the larynx of guinea pigs were detected using immunohistochemistry methods.Results AQP1 was expressed on the pseudo multiple cilium columnar epithelium，glands of the lamina propria and endotheliocyte of the micro vessel under the epidermis.AQP2 was detected on the glands of the lamina propria mucosa，AQP3 was observed on the pseudo multiple cilium columnar epithelium.AQP4 was expressed on the squamous epithelium，the pseudo multiple cilium columnar epithelium，the glands of the lamina propria mucosa and the muscular cells.AQP5 was expressed on the the pseudo multiple cilium columnar epithelium，basal cells，serous glands and pipes.The expression level of AQP1and AQP4 in the young group was higher than that in the old group，while the expression level of the AQP5 was lower（P＜0.05）.The expression level of AQP2 and AQP3 showed no significant difference between the two groups（P＞0.05）.Conclusion AQP1～5 were expressed in the larynx of the guinea pig.AQP1，AQP4 and AQP5 may be associated with the aging of the guinea pig larynx.

Guinea pig； Larynx； Aquaporin；Senium

10.3969／j.issn.1006-7299.2013.04.017

时间：2013-7-3 16：56

R332.2

A

1006-7299（2013）04-0383-04

1 武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科（武汉 430060）； 2 武汉大学人民医院病理科； 3 武汉轻工大学医学技术与护理学院

李翠娥，女，湖北人，主治医师，博士，主要研究方向为喉科学及嗓音医学。

陶泽璋（Email：taozezhang＠hotmail.com）； 周涛（Email：jasptl＠126.com）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20130703.1656.009.html