RNA干扰机制及在病毒检测领域的应用

郑 旸，康晓平，杨银辉

RNA干扰机制及在病毒检测领域的应用

郑 旸，康晓平，杨银辉

RNA干扰；病毒检测

近年来，有关RNA干扰的机制及应用成为生命科学领域的研究热点。RNA干扰的应用已经从基因组学研究逐步扩展到医学领域。利用RNA干扰不仅能提供一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术，在诸多领域如病毒的检测方面也具有非常广阔的应用前景。

1 RNA干扰现象及其机制

1.1 RNA干扰现象的发现 1990年初，Napol i等[1]在矮牵牛花中导入与花青素合成有关的查尔酮合成酶基因，本以为转基因的牵牛花会变得更鲜艳，结果却发现，一些花反而被漂白了。这种过度表达内源基因而引发的基因沉默被称为共阻遏。Carvalho等[2]在纯合子植物、Brusslan等[3]在拟南芥属、Angenent等[4]在喇叭花中又相继发现了类似的共阻遏现象，即内源和外源转入的基因转录本在转录后水平都显著减少，出现明显的基因沉默现象。除了植物，1992年Romano等[5]在粗糙链孢霉中发现了外源导入基因可以抑制具有同源序列的内源基因的表达，1995年，Guo等[6]在线虫中也发现了类似的基因沉默现象。1998年Fire等[7]发现所谓的基因沉默现象是由于部分mRNA被同源的dsRNA降解，导致相关基因的表达受到抑制，他们正式将这种现象命名为RNA干扰。而Fire等也由于在RNA干扰研究中的贡献获得2006年的诺贝尔生理及医学奖。

1.2 RNA干扰的机制 RNA干扰（RNAi）是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。这种现象发生在转录后水平。RNAi与转录后基因沉默在分子层次上被证实是同一种现象，又称为转录后基因沉默（PTGS）。RNAi是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。

外源dsRNA进入细胞后可被宿主RNA干扰机制识别，进而募集核酸内切酶将dsRNA剪切加工为小干扰RNA（siRNA），产生的siRNA的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物（RISC），RISC具有结合和切割mRNA的作用从而介导RNA干扰的过程，见图1。

图1 细胞内的RNA干扰机制图

2 RNAi的种类及其作用机制

RNAi现象是由生物体内一类非编码的双链小RNA所介导的，而内源小RNA种类各异，主要可归纳为3类：miRNA（microRNA）、siRNA和piRNA（piwiRNA）。针对miRNA和siRNA的研究起步较早，研究也较为深入。自2006年发现piRNA后又一次掀起了小RNA研究的热潮[8]。本文着重介绍miRNA和siRNA。

2.1 miRNA miRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链 RNA前体经过Dicer酶加工后生成，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。miRNA能够通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控。miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的l in-4和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNA。

miRNA与靶mRNA的作用模式有如下几种：当二者不完全互补，即二者不完全配对结合时，主要影响翻译过程而对mRNA的稳定性无任何影响[9]（哺乳动物中比较普遍），如线虫的l in-4。然而，最近也有证据表明，有些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性，这类miRNA的结合位点通常在mRNA的3′端非编码区。当二者完全互补，即二者完全配对结合后，类似siRNA与靶mRNA的结合，特异性地切割mRNA（在植物中比较常见），如miR39/miR171。此时miRNA也能像siRNA一样识别切割靶mRNA[10]。通过这种机制作用的miRNAs结合位点通常都在mRNA的编码区或开放阅读框中。

2.2 siRNA siRNA也是一种长度为21～25 nt的小RNA，其中包括5个磷酸盐、2个核苷和3个悬臂，在RNA沉默过程中起主要作用。siRNA和miRNA均属于非编码RNA（ncRNA），且都是长度约21～25 nt的小分子RNA（smal l RNA），二者关系密切。虽然siRNA和miRNA非常相似，但是它们的产生途径、功能以及对靶RNA的作用都是有所区别的。对siRNA和miRNA进行比较[11]，见表1。

正如前面提到的miRNA与靶mRNA的作用模式中，miRNA有一种作用模式类似于siRNA与靶mRNA的结合，同样，Doench等[12]发现，在siRNA与靶RNA的作用模式中，也有一些siRNA可以像miRNA那样，它主要影响翻译过程，抑制基因的表达而不影响mRNA的稳定性。因而miRNA与siRNA之间并不存在严格意义上的界限，既有个性也有共性。

另外，Pak等[13]研究发现，在RNA干扰过程中，存在一类特殊的小RNA群体，即次级siRNA，能导致不同种群之间出现不同的初级和次级效应。同时，Si jen等[14]发现几个次级siRNA序列开始于一些初级siRNA下游，因而推测次级siRNA是一种不同类型的小RNA，其产生依赖于RNA聚合酶（RdRP）。在线虫中，初级siRNAs可作为RdRP的模板产生次级siRNAs。这种信号放大过程是线虫的RNAi效应所必需的[15-16]。

3 RNAi在病毒检测领域的应用

自从发现RNAi现象以来，RNAi一直是生命科学研究的热点。RNAi作为后基因组时代的一种下调基因表达的工具已被广泛用于基因功能的研究、疾病的诊断、基因治疗、农业生产和病原微生物检测等方面，下面我们以病毒为例，着重阐述一下RNAi在病毒检测方面的应用。

RNAi是节肢动物抗病毒的关键机制，虫媒病毒的感染能够诱发RNAi机制，近些年关于RNAi的研究多见于病毒致病或者宿主抗病毒的机制研究，极少应用于病原微生物检测等方面。Myles等[17]研究表明，虫媒病毒在自然界中的维持需要一个生物链循环，脊椎动物和无脊椎动物（包括蚊等）对于病毒入侵产生的响应不同。病毒在人和节肢动物中导致了较为明显的发病率和死亡率，而在蚊虫体内却存在着一种抗病毒的RNAi机制，限制了病毒的复制。他们在感染病毒的蚊体内获得了长度为21 nt的病毒源性siRNAs，它们横跨了整个病毒的基因组并且有着不对称的分布，研究结果表明一个外生的siRNA途径对于感染病毒的蚊来说是至关重要的，也是某些病毒能够在自然界中维持的原因。Orban等[18]研究了在果蝇细胞中被RISC作为目标的mRNA的降解途径，长的dsRNA分子首先要被核酸内切酶加工成21～22 nt的siRNAs，它们被结合成RISC，并利用互补性来裂解mRNA。Myles等[19]同样发现许多虫媒病毒在自然界中的持续传播依靠的是一个固定的、无病毒感染的蚊载体的确立，进一步表明了蚊中由小RNA指导的抗病毒免疫的重要性，同时导致RNA沉默的这些小RNA的起源也成了讨论的话题。最后他们总结出了一些证据表明蚊虫中甲病毒在复制过程中产生的双链中间体引发了一种外生的siRNA途径，也就成了病毒源性siRNAs的起源。

表1 siRNA和miRNA的比较

Nakamura等[20]应用了一种新的高通量测序的方法对他们采集到的鼻咽和排泄物样本中的病毒进行了检测，实验结果表明了他们的高通量测序方法是有效的，可以不需要进一步的遗传信息。尽管主要的读长是宿主源性基因组，但是所测得的不同病毒小片段也覆盖了78%～98%的病毒基因组，对于发现一些很难用传统手段检测的新病毒还是很有利的。这项高通量测序技术若应用于RNAi机制中产生的siRNAs的检测，可用于病毒的发现。Scot t等[21]利用登革2型病毒同时感染蚊Aag2细胞和C6/36细胞株，并采用高通量测序技术对两者产生的病毒小RNAs进行比较，发现Aag2内的小RNA均是长dsRNA被Dicer裂解后的产物，而C6/36细胞株却不能有效利用Dicer来裂解长的dsRNA，表明Aag2细胞宜于产生siRNA而C6/36细胞不能有效利用Dcr2这个RNAi途径的关键起始因子来裂解长的dsRNAs。

Qingfa Wu等[22]阐述了虫媒病毒感染宿主细胞后引发的RNAi机制，并同时介绍了siRNAs、miRNAs和piRNAs。他们利用FHV（f lock house virus）的B2缺失突变体感染果蝇S2细胞、用FHV感染转基因线虫以及用SINV（sindbis virus）感染成年蚊，对被感染的宿主中总的小RNA进行高通量测序以获得病毒siRNAs，在多次的测序之后，通过对siRNAs序列进行比对和拼接，产生不同的重叠群，与病毒的全基因组进行比较，证明在果蝇、蚊和线虫中产生的病毒siRNAs在序列上是重叠的，并可以用于病毒基因组的组装。在这项研究中，研究人员描述了一种能通过无脊椎动物中病毒siRNAs的高通量测序和装配来发现病毒的方法，而这些siRNAs是宿主对于感染的免疫应答过程中所产生的。

从RNAi现象发现至今，已逐步阐明其结构、功能及机制，并将其广泛应用于基础研究和应用研究中。在病毒检测方面，可以将siRNAs视为病毒基因组的镜像片段，通过高通量测序的方法获得siRNAs并对siRNAs进行装配和拼接，获得病毒的全基因组片段，通过将高通量技术与RNAi相结合，可以直接对小RNA进行高通量测序，能够快速检测已知及发现未知虫媒病毒。虽然人类对于RNAi的研究越来越深入，但是仍然存在许多未知的领域和许多没有解决的关键性问题，例如在病毒检测中还需明确不同种属病毒对于RNAi反应的影响、siRNA的产生与病毒复制过程之间的关系、感染滴度与siRNA生成量的关系以及针对小片段哪种拼接算法最优化等等；当然，小RNA的生成途径、作用机制以及生物学功能仍需进一步明确。目前所发现的小RNA只是全部小RNA的冰山一角，而且许多已发现的小 RNA的功能还有待进一步探索。虽然面临许多困难，但是在科学家们不断地研究和探索中，RNAi技术终将被撕开一层层面纱，为人类所掌握并很好地应用于我们的生产生活当中，发挥更为重要的作用。

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（收稿：2013-08-21 修回：2013-09-02 编校：齐 彤）

Q 75

A

2095-3496（2013）04-0263-04

100071 北京，军事医学科学院五所（郑 旸，康晓平，杨银辉）