翻白草油对RSV感染宿主HeLa细胞Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达的影响

刘 蕾 陈 光 王跃新 王淑秋 张鹏霞 王柏欣 王 薇

(佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

呼吸道合胞病毒(RVS)是一群分布十分广泛的RNA病毒，可以感染呼吸道、心肌等，并造成流行性传播〔1～3〕。翻白草(Potentilla discolor Bunge)，又名鸡腿儿、鸡脚草、天青地白、白头翁、叶下白，为蔷薇科委陵菜属植物翻白草的全草，具有解毒、清热、止血消肿和止痢的作用，可治疗痢疾、疟疾、肺痈、疖痈、咯血、崩漏、疮癣。现代医学研究其具有降低血糖、抗病毒、抗菌和降低血脂〔4～6〕等丰富的药理作用，且毒副作用低。

1 材料与方法

1.1 材料 HeLa细胞株和RSV病毒株由佳木斯大学病理生理学教研室保存。翻白草油由本实验室提取，血清、RPMI1640培养液、双抗(青霉素-链霉素)均购自美国GIBCO公司;β-actin、兔源Bcl-2多克隆抗体、兔源Bax和辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG抗体购自美国Santa公司;脱脂奶粉购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HeLa细胞株在10%RPMI1640细胞培养液(10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)，37℃，5%CO2培养，约80%以上融合时取0.25%胰蛋白酶－0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化，传代。

1.2.2 药物配制 用细胞维持液(含2%胎牛血清)将翻白草油(65.6 mg/ml)按1∶20、1∶40等比例进行2倍倍比稀释，0.22μm滤器抽滤除菌，4℃条件下保存。

1.2.3 病毒毒力测定 病毒毒力用50%细胞感染量(CCID50)表示。将 RSV液从10－1～10－10做10倍系列稀释。将各稀释度的RSV液接种HeLa细胞，设阴性对照，且每一稀释度设8个复孔，培养3～5 d，观察和记录细胞病变(CPE)。CCID50用Reed-Muench法求出。

1.2.4 翻白草油对HeLa细胞毒性测定 将不同浓度的翻白草油分别加入HeLa细胞已长成单层的96孔细胞培养板中，每个浓度重复8个复孔，同时设立正常细胞对照，置于37℃、5%CO2培养箱内培养，连续观察3 d，记录细胞形态变化。培养结束前4 h，吸弃培养板中液体，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，每孔加入MTT(5 mg/ml)20μl，于37℃培养箱中培养4 h，去上清后每孔加DMSO 200μl，微量振荡器振荡5 min，酶标读数仪比色(波长490 nm)测吸光度值。实验重复3次。

1.2.5 翻白草油抗RSV的作用方式 每一浓度设4个培养瓶，实验同时设病毒对照。(1)药物配制:用2%RPMI1640维持液(含2%胎牛血清)将翻白草油进行稀释浓度为0.1、0.025、0.006 3 mg/ml，0.22 μm 微孔滤器抽滤除菌，4℃ 保存备用。(2)100 CCID50RSV病毒液配制:用2%RPMI1640维持液将RSV病毒原液1 000倍稀释，0.22μm微孔滤器抽滤除菌，4℃保存备用。(3)对RSV的直接灭活作用:不同浓度的翻白草油分别与100 CCID50RSV液等量混合，37℃作用2 h后，将其接种HeLa细胞，37℃吸附2 h后，弃上清，加5 ml维持液。(4)在生物合成阶段对RSV的作用:在长成单层Hela细胞上，接种0.5 ml的100 CCID50RSV病毒病毒液，37℃吸附2 h，弃病毒液，加入不同浓度的翻白草油5 ml。不同浓度的翻白草油分别与100 CCID50RSV液等量混合，立即加入HeLa细胞中，37℃，吸附2 h后，弃培养瓶液体，加入维持液5 ml。(6)药物对细胞预处理作用:预先加入不同浓度的翻白草油5 ml于HeLa细胞，37℃条件下，作用4 h后，PBS洗3次后，加入100 CCID50RSV液0.5 ml，37℃条件下，吸附2 h，弃RSV液上清，加入细胞维持液5 ml。

1.2.6 Western印迹检测Bcl-2蛋白和Bax蛋白的影响 裂解细胞样品，测定蛋白含量，100℃、5 min蛋白变性，经100 V、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后，260 mA电转移到聚偏二氯乙烯(PVDF)膜，Tris盐酸缓冲液(TBST)缓冲液漂洗。5%脱脂奶粉37℃封闭1 h，TBST漂洗，Bcl-2蛋白或Bax蛋白兔源多克隆抗体4℃过夜孵育，TBST漂洗，HRP标记二抗37℃，90 min，TBST漂洗。增强化学发光法(ECL)显色试剂显色，对照Marker记录实验结果。将结果进行拍照，用凝胶图像处理系统分析目标条带的净光密度值。

1.3 统计学方法 应用SPSS统计软件进行分析，方差分析调用Proc GLM过程，组间比较采用Dunnet t检验。

2 结果

2.1 RSV毒力测定 用普通光学倒置显微镜观察CPE，与HeLa细胞对照组相比，RSV作用的HeLa细胞收缩变圆，典型串珠样改变。72 h后，CPE阳性细胞为50%HeLa细胞出现病变;CPE阴性细胞未出现细胞病变。通过Reed-Muench法计算RSV液对HeLa细胞的毒力为105.8CCID50/L，本实验病毒攻击量为103CCID50/L。

2.2 翻白草油对宿主Hela细胞毒性作用 翻白草油对宿主HeLa细胞毒性作用表现为细胞增殖缓慢、细胞皱缩变圆、颗粒增多、折光性增强、部分细胞出现破碎脱落等，HeLa细胞活力随着翻白草油浓度的降低，逐渐增加，翻白草油的最小毒性浓度是0.10 mg/L。见图1。

2.3 Western印迹检测翻白草油对RSV感染宿主HeLa细胞Bax蛋白和Bcl-2蛋白的影响 翻白草油(除翻白草油预处理作用方式)组与病毒组比较，宿主HeLa细胞Bax蛋白的表达明显降低(P＜0.05)，而Bcl-2蛋白的表达明显增加(P＜0.05)。见图2。

3 讨论

植物挥发油的主要成分是倍半萜烯、萜烯、酯和醇等。研究发现，其具有抗癌、抗菌和抗病毒等多种药理作用〔7〕，因此，植物挥发油的研究日益受到人们的重视。翻白草油是传统中药翻白草的挥发油，是传统中药，性味苦，平。翻白草应用历史悠久，《本草纲目》和《救荒本草》等医药典籍记载，功用主要为治痢疾、疮疥、祛风湿和解毒等。现代药理学研究证实翻白草具有降低血糖、血脂和抗病毒、抗菌等多种药理作用。但抗RVS作用的研究较少。

细胞凋亡是生命的基本特征之一，一种由基因调控的而使细胞主动有序的死亡过程，是机体生长发育、细胞分化、生理及病理性死亡的重要机制。细胞凋亡与细胞增殖共同维持机体正常生长发育和内环境稳定。细胞增殖与凋亡失控导致许多疾病的发生。凋亡一般由细胞外的调节因素与其在细胞表面的受体结合而启动。

Bax/Bcl-2系统介导的细胞凋亡途径是目前研究较为深入的有关细胞凋亡的信号传导。细胞凋亡的发生和发展取决于促凋亡与抑凋亡成员间的相对浓度，Bax和Bc1-2是Bcl-2癌基因家族中功能相反的两个重要成员，分别为促凋亡类蛋白抗凋亡类蛋白，Bcl-2/Bax比值决定细胞是否进入内源性凋亡途径，当Bax占优势时，细胞进入线粒体依赖的内源性凋亡途径，反之，则不能进入〔8〕。Bax在正常细胞中主要分布在细胞质，在凋亡刺激因子的作用下，可以发生转位与线粒体相互作用，破坏线粒体膜的完整性，使线粒体内某些促凋亡分子外流，进而活化基质金属蛋白酶(caspase-9)，激活caspases-3分子，启动细胞凋亡过程〔9〕。Bc1-2在线粒体外膜和 bax结合形成异构二聚体阻止bax对线粒体的损伤，以维持线粒体膜的完整性，抑制细胞凋亡Bax/Bcl-2系统介导的细胞凋亡〔10〕。病毒感染与宿主细胞凋亡有着密切的联系，病毒感染宿主细胞后，通过各种机制参与宿主细胞凋亡的诱导〔11，12〕，

本研究结果提示RSV可能通过抑制凋亡抑制基因 Bcl-2的表达，增加凋亡促进基因Bax的表达，导致caspase-3被激活，通过内源性(线粒体途径)诱导Hela细胞凋亡。另外，在三种作用方式下翻白草油抗RSV作用可能与抑制RSV引起的宿主细胞凋亡有关。翻白草油抗RSV病毒中线粒体途径起主要作用，但对于该过程具体的调控机制、相关的分子机制以及是否涉及其他信号分子，可能还有其他途径参与，还需做进一步的实验研究。

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