MMP－9和PTEN蛋白在胶质瘤中的表达特点及意义

李秋阳，陈惠丽，李 宁，吴 芳，田 陈，苏春祥，王梓祯

（首都医科大学电力教学医院 病理科，北京100073）

胶质瘤是最常见的颅内肿瘤，其浸润性生长的生物学特性是治疗不佳的主要原因。基质金属蛋白酶9（Martix Metalloproteinase 9，MMP－9）是金属蛋白酶中具有代表性的主要成员之一，目前很多学者在多种肿瘤中已证实恶性肿瘤细胞通过金属蛋白酶降解细胞外基质以突破组织屏障而发生转移。第10号染色体同源丢失性磷酸酶－张力蛋白基因（PTEN）是迄今为止发现的碱性磷酸酶家族中第一个肿瘤抑制基因，位于人类染色体10q23，研究发现，在人类多种肿瘤中该基因发生突变。PTEN蛋白是定位于细胞质的磷酸酶，在肿瘤细胞的分化、浸润、转移等环节起重要作用。

本研究利用组织芯片和免疫组织化学技术检测MMP－9和PTEN在胶质瘤组织中的表达特点，并探讨它们的意义和相互关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 67例胶质瘤标本来自2000年1月至2004年9月北京电力医院神经外科收治的患者，经手术切除术后病理诊断为胶质瘤。其中男性41例，女性26例，年龄15－68岁，平均年龄（43.6＋－11.5岁）。按照WHO2000中枢神经系统肿瘤分类标准：2级31例，3级11例，4级25例。正常脑组织标本8例，取自同期经手术切除病理诊断为脑脓肿病例。

1.2 组织芯片的制备 肿瘤标本常规固定、包埋、切片及HE染色，光学显微镜下选择能够代表肿瘤特点的目标组织区域，分别在组织切片和相应的蜡块上标记。

1.2.1 组织芯片蜡块的制作 运用组织芯片手动制作仪细针打孔的方法制作芯片［1，2］，先在空白蜡块上钻孔，直径为2mm，再用金属空心针（内径为2 mm）从经定位的目标蜡块上钻取组织（一般深度为2－3毫米），并转移到已钻孔的空白蜡块的相应位置，每例组织取一个位点，如此反复将所有标本整齐有序地安插在空白蜡块中，制成组织芯片蜡块。制成的两个组织芯片均为8×5点阵，起始处用1例睾丸组织定位。总共包括67例肿瘤组织和8例正常脑组织。如图1所示。

1.2.2 组织芯片蜡块切片 与常规组织切片相同，切片厚度为4微米，使用APES载玻片，置于4度冰箱保存。如图1所示。

图1 组织芯片蜡块和经HE染色的组织芯片切片

1.3 免疫组织化学染色 免疫组织化学采用En－Vision法。选用的一抗有鼠抗人MMP－9、PTEN多克隆抗体及PV6001、DAB显色试剂盒。以上均购自中杉生物技术开发有限公司。组织芯片常规脱蜡、水化，室温下3%H2O2封闭内源性过氧化物酶5分钟；100度高温、pH6.0柠檬酸修复15分钟；滴加鼠抗人多克隆抗体（抗体稀释度1∶100）；滴加PV6001试剂；DAB显色，复染后脱水、透明、封片。试剂公司提供的阳性对照作为阳性对照，PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.4 染色结果判定标准 MMP－9和PTEN蛋白主要定位于细胞浆，其阳性信号均为棕黄色颗粒。采用复旦大学附属肿瘤医院提出的判断标准，首先将着色强度计分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕黑色。再按阳性细胞的百分比计分：无阳性细胞为0分，阳性细胞数≤10%为1分，11%－50%为2分，51%－75%为3分，＞75%为4分。将染色强度与阳性细胞百分比乘积作为标准：0－3分为“－”，4－6分为“＋”，7－9分为“＋＋”，10－12分为“＋＋＋”。如图2所示。

1.5 统计学分析 采用SPSS11.5for windows统计软件，非肿瘤组和肿瘤组组间 MMP－9、PTEN表达情况的比较采用卡方检验，不同病理分级组别MMP－9、PTEN 表达情况比较采用 Kruskal－wallis秩和检验，MMP－9、PTEN之间的相关性分析采用Spearman等级相关，以P＜0.05判定为差异具有统计学意义。

图2 MMP－9和PTEN蛋白免疫组化染色（EnVision法，400×）

2 结果

2.1 免疫组织化学结果

本研究制作包括8例正常脑组织和67例胶质瘤的组织芯片。免疫组织化学阳性信号为棕黄色颗粒，MMP－9、PTEN蛋白主要定位于胞浆。

2.2 正常脑组织和不同 WHO级别胶质瘤的PTEN表达情况。

8例正常脑组织中PTEN全部表达，阳性率为100%。67例胶质瘤中33例呈阳性表达（49.25%），经卡方检验发证实正常组和肿瘤组之间PTEN的表达差异具有统计学意义（P＜0.05）。其中31例WHO2级胶质瘤PTEN－ ～＋＋＋表达百分率 分 别 为 41.94%、38.7%、19.35%、0，11 例WHO3级胶质瘤PTEN－ ～＋＋＋表达百分率分别为54.55%、36.36%、9.09%、0，25例 WHO4级胶质瘤PTEN－ ～＋＋＋表达百分率分别为60%、32%、8%、0，发现WHO级别越高的胶质瘤其PTEN表达下降，经Kruskal－Wallis秩和检验证实各级别间的PTEN表达差异具有统计学意义（P＜0.05，见表1）。

表1 8例正常脑组织及67例不同WHO级别胶质瘤中PTEN的表达

2.3 正常脑组织和不同 WHO级别胶质瘤的MMP－9表达情况。

8例正常脑组织中有7例呈MMP－9阳性表达，阳性率为75%。67例胶质瘤中62例呈阳性表达（92.5%），经卡方检验证实，正常组和肿瘤组之间MMP－9的表达差异不具有统计学意义（P＞0.05）。其中31例WHO2级胶质瘤MMP－9－ ～＋＋＋表达百分率分别为9.68%、32.26%、35.48%、22.58%，11例WHO3级胶质瘤MMP－9－～＋＋＋表达百分率分别为18.18%、36.36%、45.45%、0，25例 WHO4级胶质瘤MMP－9－ ～＋＋＋表达百分率分别为0、24%、56%、20%，发现WHO级别越高的胶质瘤其MMP－9表达增强，经Kruskal－Wallis秩和检验证实各级别间的MMP－9表达差异具有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 8例正常脑组织及67例不同WHO级别胶质瘤中MMP－9的表达

2.4 胶质瘤中MMP－9与PTEN表达相关性

67例胶质瘤MMP－9和PTEN的表达情况如表3。经Spearsman相关分析证实，MMP－9的表达与PTEN的表达无相关性（P＞0.05）。

表3 67例胶质瘤中MMP－9与PTEN的表达关系

3 讨论

胶质瘤起源于神经外胚层，其主要特征呈浸润性生长、容易复发。时至今日胶质瘤的治疗仍然是神经外科领域的重大难题。研究发现，胶质瘤的浸润和转移过程涉及肿瘤细胞黏附、基质降解、细胞迁移等许多环节，细胞外基质在肿瘤的浸润和侵袭过程中起着关键作用。胶质瘤细胞可以分泌蛋白水解酶降解、破坏由细胞间质组成的细胞外基质，促进肿瘤侵袭转移。因此，了解肿瘤细胞浸润机制将有可能为胶质瘤的治疗带来突破性进展。

基质金属蛋白酶（Martix Metalloproteinase，MMPs）是蛋白水解酶中较为重要的一类，它们通过对细胞外基质的降解促进肿瘤细胞向周围组织侵袭。目前普遍认为，MMPs涉及恶性肿瘤相关的多个过程，包括肿瘤侵袭、转移、血管生成及肿瘤的增殖［3］。其中 MMP－9是分子量为92kDa的明胶酶B，由巨噬细胞、结缔组织和某些肿瘤细胞合成分泌，与组织发生、伤口愈合以及肿瘤的浸润转移密切相关。我们的研究发现，MMP－9在胶质瘤中的阳性表达率（92.62%）高于正常脑组织（75%），但统计学检验没有显著性差异（P＞0.05），我们考虑可能由于实验纳入的正常脑组织样本过少有关。研究发现随着胶质瘤恶性级别的升高，MMP－9表达增强（P＜0.05），这说明 MMP－9的表达与胶质瘤的侵袭性密切相关。有研究表明，应用Northern blotting和免疫组织化学技术对临床组织标本检测表明，胶质瘤中存在MMP－9的转录和表达并随胶质瘤恶性程度的增高其转录和表达水平亦明显增加，提示胶质瘤的侵袭性与其MMPs表达与活化有密切关系［4－5］。

PTEN是具有磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，研究发现，在人类多种肿瘤中该基因发生突变。PTEN蛋白定位于胞浆，主要功能区位于N端，是酶的催化中心。PTEN的肿瘤抑制作用主要依赖其脂质磷酸酶活性，但其蛋白磷酸酶活性仍可以影响细胞增殖、黏附和细胞迁移［6－8］。大量研究表明，PTEN在许多肿瘤中表达缺失，在肿瘤细胞的增殖、分化和肿瘤浸润转移中起到一定作用。本研究发现，PTEN在胶质瘤的阳性表达率（49.25%）明显低于正常脑组织（100%）（P＜0.05），提示PTEN基因突变或丢失、灭活在胶质瘤的发生过程中起到重要作用。本研究还提示，随着胶质瘤恶性程度的升高，PTEN蛋白阳性表达降低（P＜0.05），提示PTEN基因异常与胶质瘤恶性转化有关，这与其他学者的研究结果相同［9］。因此我们推断PTEN表达下调或缺失在由低度恶性胶质瘤向高度恶性胶质瘤的转化过程中起着十分重要的作用。

胶质瘤是一种多种基因异常的疾病，癌基因的激活和过表达及抑癌基因的突变、缺失使肿瘤逃避正常生长调控机制而失控增殖［10］。因此有必要联合多种基因来细分研究。文献报道PTEN主要通过调节P130蛋白、基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子的活性影响肿瘤细胞的增长、侵袭等生物学行为。我们知道PTEN基因表达异常与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，其能通过影响FAK的磷酸化在肿瘤的浸润、血管生成过程中起作用，能够影响细胞局部黏附和运动迁移能力。Hwang发现，PTEN可以调节MMPs表达，进而调节肿瘤细胞的迁徙和转移。本实验结果显示，67例胶质瘤中，MMP－9与PTEN的表达没有相关性（P＞0.05），因此我们的研究结果尚不能支持MMP－9异常激活与PTEN基因表达缺失有密切关系这一判断。PTEN基因表达下调与MMP－9异常激活的相关性有待于多种技术方法进一步阐明。

本研究结果提示，MMP－9和PTEN在胶质瘤的发生、发展中起着重要作用，MMP－9的高表达和PTEN的表达下降提示胶质瘤的侵袭性增高，两种指标的联合应用可作为胶质瘤病理分级诊断及判断预后的重要参考依据。

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