云母对NSAIDs相关性小肠黏膜损伤COX-2及HSP70表达的影响

史久煜 浙江省宁波市鄞州人民医院消化科 宁波 315040

吕 宾 浙江中医药大学第一附属医院消化科

云母对NSAIDs相关性小肠黏膜损伤COX-2及HSP70表达的影响

史久煜 浙江省宁波市鄞州人民医院消化科 宁波 315040

吕 宾 浙江中医药大学第一附属医院消化科

目的：研究NSAIDs相关性小肠黏膜损伤COX-2及HSP70表达，探讨云母对小肠黏膜的保护机制。方法：24只SD大鼠，随机分为对照组、模型组、云母组，每组8只。模型组和云母组每天予双氯酚酸钠溶液7.8mg/（kg·d）剂量灌胃，制备大鼠NSAIDs相关性小肠黏膜损伤模型，云母组每天造模前予云母液120mg/（kg·d）剂量灌胃。灌胃给药5天后处死大鼠，进行大体形态观察，肠黏膜损伤指数（CMDI）及病理Chiu氏评分；免疫组化法检测小肠黏膜COX-2及HSP70表达。结果：与对照组比较，模型组CMDI、Chiu氏评分及COX-2、HSP70表达水平明显升高（P＜0.01）。而云母组CMDI、Chiu氏评分及COX-2表达水平较模型组有明显下降（P＜0.01），HSP70水平更进一步升高（P＜0.01）。结论：NSAIDs相关性小肠黏膜损伤与COX-2及HSP70表达有关，云母可抑制损伤小肠黏膜COX-2表达，同时增强HSP70表达，从而对小肠黏膜起到保护作用。

大鼠 肠黏膜损伤 NSAIDs双氯酚酸钠 云母 COX-2 HSP70

非甾体抗炎药（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）是一类具有抗炎、镇痛作用的药物，临床应用极为广泛，但在服用时可引起胃肠黏膜损伤。药用云母为白云母，主要成分为二氧化硅和氧化铝。《中华药海》[1]记载云母“截疟止痢、止血敛疮和温虚补肾”。《中国矿物药图鉴》[2]记录“主下痢肠癖，补肾冷”。文献[3]报道，云母具有选择性吸附作用和加强消化道黏膜屏障保护作用。本实验通过测定NSAID相关性小肠黏膜损伤COX-2及HSP70的表达，探讨云母的肠黏膜保护作用。

1 实验材料

1.1 动 物 雄性SPF级Wistar大鼠共24只，体质量280～300g，饲养于浙江中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2008-011。

1.2 药物及试剂 双氯酚酸钠肠溶片（商品名：扶他林，国药准字H11021640，北京诺华制药有限公司生产），云母粉（产地河北，购于浙江中医药大学第一附属医院中药房）分别用0.9%生理盐水配置成0.78mg/ mL、12mg/mL浓度的均匀溶液，并参照成人口服常规剂量折算成大鼠灌胃用量。HSP70 RB-080PO、COX-2 RB-9072PO为兔来源的多克隆抗体（美国labvision Neomarkern公司产品），山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体（Lot：00001360），DAB显色液（DAKO，Lot：00029661）。

2 实验方法

2.1 大鼠肠黏膜损伤模型建立 24只大鼠完全随机分为对照组、模型组和云母组，每组8只，适应1周后开始实验。对照组予0.9%生理盐水1mL/（100g· d）剂量灌胃，后两组予双氯酚酸钠溶液7.8mg/（kg· d）剂量灌胃，制备小肠黏膜损伤模型，共5天。其中云母组在每次双氯酚酸钠溶液灌胃30min前，先予云母溶液按120mg/（kg·d）的剂量灌胃保护。

2.2 标本制备 灌胃5天结束后，禁食不禁水，于次日腹腔注射5%丙戊酸钠溶液麻醉大鼠，将其仰卧固定于手术台，沿腹部正中切开，分离小肠组织，沿肠系膜纵轴剪开，用冰生理盐水冲洗净，肉眼观察大体形态，取病变最明显处组织置于10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片。

2.3 检测指标

2.3.1 一般情况和大体形态 观察大鼠在实验过程中有无死亡（死亡大鼠进行尸解查明原因），精神状态，活动情况，食欲，大便（有无血便、腹泻、大便次数增多等）和体质量改变等情况。取小肠黏膜组织肉眼观察大体形态并进行肠黏膜损伤指数（CMDI）评分，评分标准[4]：0分：无损伤；1分：轻度充血、水肿，表面光滑，无糜烂或溃疡；2分：充血水肿，黏膜粗糙呈颗粒状，有糜烂或肠黏连；3分：高度充血水肿，黏膜表面有坏死及溃疡形成，溃疡最大纵径＜1.0cm，肠壁增厚或表面有坏死及炎症；4分：在3分基础上溃疡最大纵径＞1.0cm，或全肠壁坏死。

2.3.2 病理组织学检测 取病变较明显的小肠黏膜包埋切片，HE染色，镜下评价病变黏膜，并进行Chiu氏[5]法评分：0分：正常；1分：绒毛顶端上皮下间隙增宽；2分：绒毛顶端上皮下间隙进一步扩大，绒毛尖端上皮抬高与固有膜剥离；3分：绒毛上皮成块脱落；4分：上皮完全脱落，仅有固有膜；5分：固有膜层崩裂，出现出血与溃疡。

2.3.3 COX-2及HSP70表达测定 操作步骤：石蜡切片，二甲苯脱蜡、无水乙醇、95%、80%、70%乙醇至水化；蒸馏水洗；抗原修复：COX-2、HSP70采用高温高压修复（0.01M柠檬酸缓冲溶液，pH：6.0），时间为100s；馏水洗，PBS 5min×3次；3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10min；PBS洗5min×3次；滴加适当比例稀释的一抗，4℃过夜。（COX-2 RB-9072PO工作浓度1：75；HSP70 RB-080PO工作浓度1：50，均为兔来源的多克隆抗体，用PBS代替一抗为实验空白对照）；PBS冲洗，5min×3次；滴加山羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体（Lot：00001360），37℃孵育40min；PBS冲洗，5min×3次；DAB显色液（DAKO，Lot：00029661）显色1～3min，显微镜下控制反应，自来水冲洗终止反应；Harris苏木素液复染细胞核1min，95%、100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。高倍显微镜（10×20）下观察，计分标准:①阳性染色细胞数占视野细胞总数的多少计分为A：无阳性染色细胞为0分；阳性细胞百分数＜25%为1分；25%～50%为2分；＞50%为3分。②按着色细胞染色强度计分为B：细胞呈阴性染色为0分；染色弱，阳性细胞呈淡黄色为1分；染色中等，阳性细胞呈棕黄色为2分；染色强，阳性细胞呈棕褐色为3分。以A+B值作为判断结果，进行统计分析。

2.4 统计学方法 使用SPSS16.0软件处理数据，采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 一般情况和大体形态观察 实验期间对照组大鼠一般情况良好，体质量无减轻，无腹泻、血便，无死亡，精神、活动正常，解剖示肠黏膜正常，无充血水肿糜烂等。模型组大鼠于灌胃第1、2天出现惊恐，烦躁不安等症状；第3天开始大鼠精神极度萎靡，活动减少，食欲明显减退,毛发杂乱，大便变稀，体质量减轻10～20g不等，至灌胃第4、5天，陆续有大鼠死亡，分别死亡2只和3只，尸检显示小肠黏膜多处重度糜烂坏死及肠穿孔粘连，考虑肠穿孔死亡。余存活模型组大鼠解剖示小肠黏膜明显充血水肿、糜烂，但未见肠穿孔。云母组大鼠精神状况较正常组稍差，活动，食欲一般，大便正常，体质量未见明显变化，实验期间无大鼠死亡。解剖示小肠黏膜较完好，仅见轻度充血水肿。三组大鼠胃黏膜大体形态均未见充血水肿糜烂等损伤。各组大鼠小肠黏膜损伤指数（CMDI）评分比较，模型组CMDI评分较对照组明显升高（P＜0.01），云母组大鼠CMDI评分均较模型组有明显下降（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠小肠黏膜损伤指数评分比较 只

3.2 病理观察 高倍镜（10×20）下观察所有大鼠胃黏膜未见明显病理变化。对照组大鼠小肠黏膜正常，无充血水肿糜烂等；模型组大鼠小肠黏膜上皮细胞层部分变性坏死、脱落，充血糜烂，炎症细胞浸润；云母组大鼠小肠黏膜较完好，轻度充血水肿。各组大鼠小肠黏膜病理Chiu氏评分比较，其中模型组小肠黏膜病理Chiu评分较对照组明显升高（P＜0.01），云母组小肠黏膜病理Chiu评分较模型组明显降低（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠小肠黏膜病理Chiu氏评分比较 只

3.3 云母对COX-2表达的影响 显微镜下观察阴性细胞核呈蓝色，阳性为黄色或黄棕色。其中COX-2主要以在肠组织的上皮细胞胞浆内表达为主，但固有层内的炎症细胞也有少量表达，HSP70的表达主要在肠组织的上皮细胞和固有层内的炎症细胞，阳性定位于细胞浆或胞核内。与对照组比较，模型组COX-2表达水平明显增强（P＜0.01），云母组COX-2表达水平较模型组明显下降（P＜0.01）。见表3、图1（插页）。

表3 各组大鼠小肠黏膜组织COX-2表达比较 只

3.4 云母对HSP70表达的影响 造模后大鼠小肠黏膜HSP70表达较对照组明显增强（P＜0.01），而云母组小肠黏膜HSP70表达进一步增强（P＜0.01）。见表4、图2（插页）。

4 讨论

由于检查手段的限制，以往对NSAIDs引起的小肠黏膜损害了解较少。随着胶囊内镜（VCE）和双气囊小肠镜（DBE）的不断普及，人们发现，小肠较胃十二指肠更易受到NSAIDs的损害。Graham等[6]对慢性NSAIDs服用者行胶囊内镜（VCE）检查发现有高达71%的患者发生了小肠损伤。本实验发现经双氯酚酸钠溶液造模后的大鼠胃黏膜未见损伤，而小肠黏膜损伤明显。

表4 各组大鼠小肠黏膜组织HSP70表达比较 只

COX-2在大多数细胞中低水平表达，甚至无法检测到，但在许多病理情况下能急剧增加，被认为是一种可诱导酶，其产生跟炎症和癌症等有关。通过环氧合酶（COX）合成多种前列腺素和白三烯等炎症介质，产生红、肿、热、痛、充血、水肿、炎症细胞浸润等炎症表现，影响肠管液体的转运、肠管活动、调节免疫，使炎症反应放大或持久化[7]。在鼠和人的病变肠黏膜中均发现COX-2表达异常，尤其在溃疡边缘明显增多[8-9]。Hendel等[10]在结肠炎患者中发现，肠上皮细胞的COX-2上调，并且活动期患者明显高于非活动期患者。目前认为，COX-2主要参与病理过程，病理状态下，炎症处COX-2表达急剧增加，尤其是在急性炎症反应中起主要作用。但也有研究认为，COX-2并非有理论上的严格界限,可能对维持黏膜完整性也发挥了作用。Reuter等[11]在鼠实验性结肠炎组织中发现COX-2水平增加及前列腺素合成增多，同时还发现经选择性COX-2抑制剂处理的动物肠黏膜病变加重，甚至发生穿孔或死亡。本实验发现双氯酚酸钠溶液灌胃后的大鼠肠黏膜COX-2水平较对照组明显增高（P＜0.01），死亡率极高（5/8），而经云母治疗后肠黏膜损伤情况明显好转，COX-2表达明显下降（P＜0.01），且无1例发生死亡，提示COX-2与肠黏膜损伤程度相关。据此认为COX-2在肠黏膜损伤的作用机制中主要参与诱导炎症反应，从而导致肠黏膜的病理损害，而云母可抑制其表达，减轻炎症反应，增强肠黏膜保护作用。

热休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是生物体（或离体、培养细胞）在不良环境因素作用下所产生的一组具有高度保守性的应激蛋白，它普遍存在于整个生物界，几乎所有的细胞均能合成。正常情况下，HSP70表达很低，在病理状态下表达会增强，起自我防御作用。研究表明，哺乳动物细胞HSP70的表达主要受转录水平的调控，在非应激条件下HSF（热应激转录因子）是以单体形式存在，应激后HSF单体的空间构象发生改变，暴露出疏水重复序列，使HSF单体聚集成具有DNA结合能力的三聚体。在应激状态下，HSF与变性蛋白竞争结合HSP70，当变性蛋白增多时，游离的HSF也增加，从而诱导HSP70的合成，直至HSP70的含量足够结合HSF，使HSF处于抑制状态。HSP70作为HSP家族中最保守最主要的一组蛋白质，在保护肠黏膜上皮细胞方面具有重要的作用[12-14]。Galois等[15]采用基因转染方法，使巨噬细胞过度表达HSP70，然后应用内毒素分别刺激转染和未转染的细胞，结果发现HSP70能明显抑制iNOS、TNF-α等细胞因子的释放，减轻炎症反应，从而起到保护细胞的作用。Jayakumar等[16]报道肠黏膜屏障损伤引起内毒素血症时，HSP基因缺乏的鼠死亡率及血促炎细胞因子水平明显高于正常鼠。本实验发现云母也能促进肠黏膜HSP70的表达，增强肠黏膜保护作用。有关HSP70的研究已成为分子生物学的热点之一，且逐渐为治疗提供了新途径[17]。总之，HSP70的细胞保护作用现已经得到多数实验的支持，因而在保护肠黏膜的治疗中诱导细胞HSP70的表达是值得期待的方向。

综上所述，云母能抑制损伤小肠黏膜COX-2的表达，同时增强HSP70的表达，从而促进肠黏膜的愈合，这可能是云母保护肠黏膜屏障的重要机制之一。

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Effects of Mica on COX-2 and HSP70 of NSAIDs-induced small intestinal damage

SHI jiuyu，LV bin.Yinzhou People's Hospital，Ningbo（315040），China

Objective：To study the effect of mica on the expression of COX-2 and HSP70 in non-steroidal anti-inflammatory drugs（NSAIDs）-induced small intestinal damage and to approach the protective mechanism of mica.Methods：Twenty-four rats were randomly divided into control group，model group，and mica group，8 rats in each group.With the exception of rats in control group，all rats were intragastrically administered with diclofenac sodium（7.8 mg/kg）for 5 days to establish the model of NSAIDs-induced small intestinal damage.The rat in mica group were given daily intragastric administration of mica（120mg/kg）before administration of diclofenac sodium.All rats were killed on day 5.At that time,the colonic mucosal damage index（CMDI）and Chiu score were evaluated and the expression of COX-2 and HSP70 were measured by biochemical and immunohistochemical methods.Results：Compared with control group，the rat in model group had significantly increased CMDI，Chiu score，and COX-2 and HSP70（P＜0.01）.Mica treatment resulted in significantly decreased CMDI，Chiu，and COX-2，but more activities of HSP70 in comparison with model group（P＜0.01).Conclusion：NSAIDs-induced small intestinal damage was related to the expression of COX-2 and HSP70，and mica may offer protective effects against the damage by decreasing the expression of COX-2 and increasing the expression of HSP70.

rats intestinal damage NSAIDs diclofenac sodium mica COX-2 HSP70

2013-08-01

吕宾，E-mail：Lvbin@medmail.com.cn