时间分辨自体荧光光谱区分人体正常和癌变结肠组织

刘秉扬，聂英斌

（1.三明学院机电工程学院，福建三明365004；2.福建师范大学医学光电科学与技术教育部重点实验室，福建福州350007）

时间分辨自体荧光光谱区分人体正常和癌变结肠组织

刘秉扬1，聂英斌2

（1.三明学院机电工程学院，福建三明365004；2.福建师范大学医学光电科学与技术教育部重点实验室，福建福州350007）

实验测量了在405 nm的脉冲激光激发下，人体离体正常和癌变结肠组织在635 nm荧光发射峰的时间分辨自体荧光光谱特性。采用双指数衰减方程对时间分辨自体荧光光谱进行拟合，得到相应的平均荧光寿命。结果显示：人体正常和癌变结肠组织在405～635 nm激发发射波长条件下的自体荧光平均寿命分别为（4.87±0.75）ns和（13.27±3.31）ns，二者存在显著差异。采用时间分辨自体荧光光谱区分人体正常和癌变结肠组织的灵敏度和特异性分别为100％和93％。初步表明时间分辨自体荧光光谱有望用于诊断早期结肠癌。

时间分辨自体荧光光谱；荧光寿命，结肠组织；组织诊断

随着激光技术的发展，采用激光诱导荧光技术对肿瘤进行早期诊断已经成为当前临床诊断医学领域的一个重要课题，备受国内外许多研究小组的关注［1－3］。与传统的病理检查相比，激光诱导荧光技术具有安全、无损、快速和实时在体检测等优点［4］。激光诱导荧光发射包括稳态光谱（频域）特性和时间分辨（时域）特性两个方面。稳态荧光光谱主要测量在特定激发波长条件下的荧光发射光谱，通过比较荧光发射峰位置和强度等方面的信息来判别正常与病变组织。但是稳态荧光光谱受到生物组织体内环境和光学系统等因素的影响，无法全面表达生物组织的内源性荧光物质所处的微环境的物理和化学性质。时间分辨自体荧光光谱技术不受到上述条件的限制，可以从时间弛豫和动力学角度对荧光物质成分进行全面深入的研究，达到全面表征生物组织内源性物质生化特性的目的［5］。

当前国内外许多研究小组主要致力于稳态自体荧光光谱诊断早期肿瘤的研究，而利用时间分辨自体荧光光谱诊断早期结肠癌方面却鲜见报道。结肠癌作为一种常见的消化道恶性肿瘤，在我国其发病率仅次于胃癌和食道癌位居胃肠道肿瘤的第三位［6］。传统的临床手术活检方法在诊断早期结肠癌中具有很大的主观随机性，不一定能准确、全面地对病灶位置定性，且活检所需时间长、步骤多，不能实现在体的实时诊断［7-9］。因此，临床上亟待寻找一种能正确指导或替代活检的准确、快捷的诊断方法。实验研究了人体离体结肠组织的时间分辨自体荧光光谱，结果表明：人体正常和癌变结肠组织在405～635 nm激发发射波长条件下的自体荧光平均寿命分别为（4.87±0.75）ns和（13.27± 3.31）ns，两者之间存在显著差异。采用时间分辨自体荧光光谱区分人体正常和癌变结肠组织的灵敏度和特异性分别为100％和93％。

1 材料与方法

1.1 组织样品

实验样品取自福建省立医院普通外科肠癌切除手术，每组样品均包含实验组（癌变）和对照组（正常）。每个样品均分为两份，其中一份送临床病理分析，另外一份采用生理盐水进行清洗，离体2 h之内完成时间分辨自体荧光光谱测量。

1.2 实验仪器

实验采用FLS920（Edinburgh Analytical Instruments，UK）荧光光谱探测系统，该系统的狭缝大小可以根据所检测荧光信号的强弱进行连续调节，同组实验条件保持一致。选取脉冲宽度为90 ps的二极管激光器（405 nm，350 mW，Edinburgh Instruments Ltd，UK）作为激发光源。

2 结果与讨论

人体离体正常和癌变结肠组织在405 nm激发下的归一化自体荧光发射光谱如图1所示，由图可知，人体正常和癌变结肠组织均在520和620 nm处存在发射峰。与正常组织不同的是，癌变组织在620 nm处的峰位发生约15 nm的红移，并且在690 nm处还存在一个特征峰。根据文献报道520 nm处的荧光发射峰是由人体内源性荧光物质FAD产生，而635 nm和690 nm的荧光则是内源性卟啉特异性产生［10-11］。从稳态荧光光谱可知，人体癌变结肠组织中的内源性卟啉相对含量显著高于正常组织。为了深入分析两种内源性荧光物质组分的相对含量差异，文章进一步测量了两种组织体的时间分辨自体荧光光谱。

实验测量了14组人体正常组织与癌变结肠组织离体样品在405 nm激发下，635 nm处的时间分辨自体荧光光谱。人体离体正常和癌变结肠组织的时间分辨荧光光谱如图2所示，对所获得的时间分辨荧光光谱数据采用拟合公式(1)进行双指数拟合，拟合优度R2均接近1。式中A1和A2是指前因子，代表了每种内源性荧光物质对总的荧光信号的贡献；τ1和τ2分别代表各单一组分的荧光物质的荧光寿命。通过拟合实验所得的荧光衰减曲线，就可以计算出揭示荧光衰减本质的平均荧光寿命。

图1 人体正常和癌变结肠组织在405 nm波长激发下的归一化荧光发射光谱

考虑不同组织样品的组织体差异性，进一步计算正常和癌变结肠组织的平均荧光寿命，采用公式(2)计算得到的人体正常与癌变结肠组织的平均荧光寿命如表1所示，人体正常和癌变结肠组织在405～635 nm激发发射波长条件下的自体荧光平均寿命分别为（4.87±0.75）ns和（13.27±3.31）ns，两者之间存在显著差异（P＜0.001）。

图2 人体正常和癌变结肠组织的时间分辨自体荧光光谱

表1 人体正常与癌变结肠组织的平均荧光寿命

结果显示，不管是正常还是癌变结肠组织，荧光寿命较短的内源性荧光物质的比例都比长寿命内源性荧光物质比例高，在正常组织和癌变组织中两种组分的相对比例分别约为（3∶1）和（2.3∶1），说明这两种内源性荧光成分在不同组织类型内的含量存在差异。DaCosta等人［12］的研究表明内源性卟啉的荧光寿命为（14.94±0.06）ns，这与文章测量得到人体癌变结肠组织405～635 nm处的荧光寿命为（13.27±3.31）ns吻合，说明人体癌变结肠组织中的内源性卟啉含量显著高于正常组织。

实验统计结果表明人体正常和癌变结肠组织在405～635 nm激发发射波长条件下的自体荧光平均寿命分别为（4.87±0.75）ns和（13.27± 3.31）ns，其平均荧光寿命及其标准偏差如图3所示，两者存在显著性差异。选取人体正常和癌变结肠组织在635 nm处自体荧光的平均寿命区分阈值τ=7.0 ns，结合临床病理诊断结果，分析得到采用时间分辨自体荧光诊断的灵敏度和特异性分别为100％和93％。

图3 人体正常和癌变结肠组织的平均荧光寿命及其标准偏差

3 结论

人体结肠组织自体荧光的发光机理和组织体内源性荧光物质密切有关，不同组织中，由于内源性荧光物质的相对含量以及微环境不同，生理状态和细胞代谢的不同，导致其时间分辨荧光光谱存在差异。本文采用时间分辨自体荧光光谱进行人体结肠组织诊断的可行性研究。实验结果显示：人体正常和癌变结肠组织在405～635 nm激发发射波长条件下的自体荧光平均寿命分别为（4.87± 0.75）ns和（13.27±3.31）ns，两者之间存在显著差异。采用时间分辨自体荧光光谱区分人体正常和癌变结肠组织的灵敏度和特异性分别为100％和93％。实验结果说明采用时间分辨自体荧光光谱有望作为诊断早期结肠癌的一种有效手段。

［1］骆清铭，龚辉，刘贤德，等.肿瘤组织自体荧光光谱测量与分析［J］.光谱学与光谱分析，1997，17（3）：105－111.

［2］陈晓冬，郁道银，谢洪波，等.自体荧光在组织中的传输规律［J］.中国生物医学工程学报，2003，22（6）：498－502.

［3］谢洪波，邓红梅，郁道银.激光诱导荧光用于结肠肿瘤早期诊断［J］.激光杂志，1999，20（5）：21－23.

［4］李步洪，谢树森.激光光谱及其成像技术在光活检中的应用［J］.光谱学与光谱分析，2005，25（7）：1083－1087.

［5］陈明惠，林黎升，杨甫文.人体鼻咽组织的时间分辨自体荧光光谱研究［J］.激光生物学报，2007，16（4）：428－431.

［6］曹建彪，李世荣，李静，等.激光诱发大肠恶性肿瘤自体荧光光谱分析［J］.中华消化内镜杂志，1999，16（3）：146－148.

［7］LI B H，XIE S S.Autofluorescence excitat ion－emission matrices for diagnosis of colonic cancer［J］.World J Gastroenterol，2005，11（25）：3931－3934.

［8］彭健，张阳德，刘路，等.大肠癌组织激光诱导自体荧光光谱规律［J］.中国现代医学杂志，2006，16（24）：3694－3696.

［9］刘丽娜，刘秉扬，李伟华，等.人体结肠腺癌的自体荧光光谱特性研究［J］.中国激光医学杂志，2010，19（6）：353.

［10］SCHOMACKER K T，FRISOLI J K，COMPTON CC，et al.Ultraviolet laser－induced fluorescence of colonic tissue：basic biology and diagnostic potential［J］.Lasers Surg Med，1992，12（1）：63－78.

［11］刘秉扬.人体结肠组织的内源性荧光分子标记物研究［J］.三明学院学报，2011，28（6）：60－64.

［12］DACOSTA R S，ADERSON H，WILSON B C.Molecular fluorescence excitation－emission matrices relevant to tissue spectroscopy［J］.Photochem Photobiol，2003，78（4）：384－392.

Time-resolved Autofluorescence Spectroscopy for Classification of Human Normal and Abnormal Colonic Tissues

LIU Bing-yang1，NIE Ying-bin2
（1.College of Electromechanical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China; 2.Key Laboratory of Optoelectronics Science and Technology for Medicine of Ministry of Education, Fujian Normal University,Fuzhou 350007,China）

Time-resolved autofluorescence spectroscopies at 635 nm under 405 nm excitation were measured for human normal and abnormal colonic tissues in vitro.The main fluorescence lifetime of the tissues were calculated by the two-component lifetime fitting of time-resolved autofluorescence spectroscopies.The results showed that the average lifetime of normal and abnormal human colonic tissues are about(4.87±0.75)ns and(13.27±3.31)ns,respectively.In this method, the sensitivity and specificity for diagnosis of human colonic carcinoma tissue are 100％and 93％.Experimental results indicated that the time-resolved autofluorescence spectroscopies can be potentially used to distinguish early human colonic carcinoma tissue.

time-resolved autofluorescence spectroscopies;fluorescence lifetime;human colonic tissues;tissue diagnosis

R318.51

A

1673-4343（2013）02-0049-04

2012-12-15

三明学院自然科学基金项目（B201009/Q）

刘秉扬，男，福建莆田人，讲师。研究方向:生物医学光学。