抑制T细胞增殖的抗CD98重链单克隆抗体的建立

练高建，吴端生，苏泽红，安友康二

(1.南华大学实验动物学部，湖南 衡阳 421001;2.南华大学药学与生命科学学院，湖南 衡阳 421001;3.日本德岛大学大学院免疫学教研室，日本 德岛 770－8503)

CD98，又称为4F2抗原或 FRP－1，是一组与免疫应答有关的、位于白细胞表面的约200种蛋白质的其中一种，它们的迁移、与细胞间的相互作用及信号转导能激活 T细胞。Haynes等［1］的研究发现，CD98是淋巴细胞表面抗原的一种，在所有已建立的人体组织培养细胞及大部分的人体恶性肿瘤细胞中均有表达［2，3］。研究表明，CD98(4F2)在诸如细胞粘附、融合及氨基酸转运等过程中发挥重要作用。CD98(4F2)由一条 CD98重链(CD98 heavy chain，CD98hc，又称4F2hc)—Slc3a2的基因产物和一条轻链(CD98 light chain，CD98lc，又称 4F2lc)组成。30年前Haynes等［4］首次发现 CD98hc是 T细胞激活的一种标志。随后 Hemler等［2］证明，CD98与细胞的增殖及存活有关，且发现CD98高表达于增殖的组织表面。CD98具有两种不同的功能:介导整合素信号通路及氨基酸转运［5，6］;CD98hc的不同区域对这些功能发挥不同作用。但是，CD98hc对T细胞功能究竟有何种影响，目前仍不清楚。

为了寻找能调节T细胞功能的分子，我们制作了大量能识别小鼠脾细胞并且具备调节T细胞功能的单克隆抗体。其中一株杂交瘤细胞系分泌的抗体具有最强的抑制CD4+和CD8+T细胞增殖的能力，经过鉴定，发现其目标分子为 CD98hc。这是首次发现CD98hc在T细胞增殖过程中发挥重要作用，因此，有必要进一步研究，对CD98进行修饰是否能治疗一些与T细胞异常增殖诱导的相关疾病。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞系

BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠和 Wistar大鼠，均为雌性，购自日本SLC公司，饲养于德岛大学屏障环境设施内。SP2/0骨髓瘤细胞系，NIH3T3细胞系，均购自日本Riken细胞库。

1.2 试剂

聚乙二醇(PEG1500)，完全及不完全 RPMI－1640培养液，HAT培养液，均购自Sigma公司。NBS培养液，Rat IgG抗体，蛋白G琼脂糖，银染试剂盒，［3H］－亮氨酸，均购自购自Invitrogen公司。

1.3 免疫程序及融合

收集BALB/c小鼠脾细胞约2×107个，每隔10 d腹腔注射免疫Wistar大鼠，共3次，在第三次免疫后5 d，处死大鼠，收集Wistar大鼠脾细胞，与SP2/0在添加PEG1500的情况下进行融合，然后将融合后的细胞在含有 HAT的 RPMI－1640培养液中进行培养，约14 d后，对所有的杂交瘤细胞进行筛选，识别T细胞的则确定为阳性克隆。选择阳性克隆进行下一步研究。

1.4 混合淋巴细胞反应实验

分别取 C57BL/6和 BALB/c小鼠脾脏制备细胞悬液。其中 BALB/c小鼠脾细胞悬液(2×107/mL)在37℃下，加丝裂霉素 C(50 μg/mL)处理 30 min，培养液洗涤3次后用5%NBS培养液配制细胞悬液(5×106/mL)，作为刺激细胞，加入96孔培养板，每孔5×105/0.1 mL;再加入 C57BL/6脾细胞悬液，为反应细胞，也是每孔5×105/0.1 mL;再分别加入杂交瘤细胞上清及对照Rat IgG抗体。CO2培养箱培养5d，对细胞进行计数。

1.5 免疫共沉淀实验

从BALB/c小鼠收集脾细胞，加入裂解缓冲液作用约15 min，然后离心收集上清，再加入 I－142于4℃共培养约2 h。然后再与蛋白 G琼脂糖共培养约1 h。用裂解缓冲液洗3遍，然后往上述反应物中加入样品缓冲液后，于95℃反应3 min，进行凝胶电泳，电泳后的凝胶用银染试剂盒银染。

1.6 细胞分布实验

配制1 mg/mL的纤连蛋白溶液用于包被96孔板，于4℃培养过夜。NIH3T3细胞及I－142于4℃共培养约20 min，然后将上述培养物加至纤连蛋白包被的96孔板中培养约12 h，每组在显微镜下观察约300个细胞，通过计算细胞扩展的百分比来测量细胞的分布。

1.7 氨基酸转运实验

NIH3T3细胞(购自日本 Riken细胞库)与［3H］－亮氨酸共培养约 12 h，然后用液闪法检测［3H］－亮氨酸的掺入率。

2 结果

2.1 抑制T细胞增殖的单克隆抗体的建立

从BALB/c小鼠收集脾细胞免疫Wistar大鼠，得到大量能够识别小鼠脾细胞的杂交瘤细胞系。然后通过混合淋巴细胞反应实验筛选出43株能够促进或抑制T细胞增殖的杂交瘤细胞系。其中一株杂交瘤细胞系所分泌的单克隆抗体对T细胞增殖具有最强的抑制效果(图 1)，我们将其命名为 I－142，并对其进行进一步的研究。

2.2 单克隆抗体识别的目标分子

将从BALB/c小鼠收集的全脾细胞的裂解液与I－142单克隆抗体进行免疫共沉淀反应，然后将其转移到凝胶上进行电泳。电泳后的凝胶进行银染，结果显示，目标带位于约75×103(图2)［7］。对切割后的目标带进行液相色谱分析，表明 I－142单克隆抗体识别的目标分子是CD98重链。

图 1 I－142 抑制 CD4+和 CD8+T 细胞的增殖(＊＊P ＜0.01)Fig.1 The antibody I－142 suppresses the proliferation of CD4+and CD8+T cells. ＊＊P ＜ 0.01

图2 I－142识别CD98重链(目标带位于约75×103处)(C:对照IgG抗体)Fig.2 The antibody I－142 recognizes CD98hc(molecular weight is about 75×103).C:control IgG antibody

2.3 I-142阻止纤连蛋白介导的细胞分布但不影响氨基酸转运

研究表明CD98hc与整合素信号通路有关联［11］。为证实I－142是否具有调节整合素信号通路的功能，我们检测了 I－142对纤连蛋白介导的细胞分布的影响。结果显示，I－142可以抑制纤连蛋白介导的细胞分布(图3A)，表明I－142具有调节整合素介导的细胞分布的功能。

CD98hc与CD98轻链形成聚合体，从而控制氨基酸的转运。我们通过添加I－142单克隆抗体来培养NIH3T3细胞，并检测［3H］－亮氨酸的掺入率。但结果表明，I－142单克隆抗体未能有效抑制［3H］－亮氨酸的掺入(图3B)，表明我们制备的I－142单克隆抗体不影响氨基酸转运。

图3 I－142阻止纤连蛋白介导的细胞分布，但不影响氨基酸转运(*P＜0.05)Fig.3 Antibody I－142 blocks fibronectin－mediated cell spreading but not amino acid transport.*P＜0.05

3 讨论

约30年前，Haynes等［1］首次发现 CD98是淋巴细胞的一种表面抗原;随后 Hemler等［2，3］的研究表明，CD98在所有已建立的人体组织培养细胞系及大部分的人体恶性肿瘤细胞上均有表达。大量的研究表明，CD98参与许多特殊的细胞活动过程，如细胞粘附、融合、细胞增殖及生长，还参与不同类型细胞的氨基酸跨膜转运。

CD98是一个由2个亚基组成的二硫化物，包括一条糖基化的CD98重链和一条非糖基化的CD98轻链，其中CD98重链是一种含529个氨基酸的II型转膜糖蛋白。已经证实，CD98重链具有很多生物学功能，如调节整合素介导的细胞粘附;通过一个二硫键与CD98轻链形成异二聚体影响氨基酸的转运;且具有调节细胞融合的功能。Feral等［8－10］的研究表明，CD98重链具有促进其他类型细胞增殖的能力，是由于其具有支持整合素信号通路而非氨基酸转运的功能;而整合素介导的信号可以控制细胞的粘附/迁移、存活及 T细胞的增殖。免疫共沉淀结果显示，我们建立的单克隆抗体，目标带位于约75×103处。液相色谱分析显示其目标分子为 CD98重链(CD98 heavy chain，CD98hc);同时，氨基酸转运实验及细胞粘附实验结果显示，我们所建立的单克隆抗体能有效抑制整合素介导的细胞粘附，但对氨基酸的转运无影响，因为CD98重链与轻链通过二硫键形成二聚体控制氨基酸的转运。因此，上述实验结果证实，我们所建立的单克隆抗体的目标分子是CD98重链。混合淋巴细胞反应结果显示，抗CD98hc单克隆抗体能有效抑制CD4+和CD8+T细胞增殖，首次揭示了CD98hc在T细胞的增殖过程中起着关键作用。

T细胞所介导的自身免疫性疾病，如多发性硬化症，1型糖尿病等，是由于自身反应性T细胞异常增殖导致的组织损伤所引发的［11，12］。T细胞表面表达有大量的共刺激受体及配体，能有效调节T细胞的增殖，功能性分化及其生存。研究显示，通过单克隆抗体选择性地作用于这些共刺激受体或配体，是治疗T细胞介导的自身免疫性疾病的有效途径。

我们所建立的抗CD98hc单克隆抗体，能有效地抑制CD4+和CD8+T细胞增殖，因此值得对其进行进一步的研究，探索将其用于T细胞介导的自身免疫性疾病的有效治疗方法。

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