H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤中TNF－α、IL－1β、IL－6 和 IL－10 的变化和作用

魏东，刘英，贾宁，徐彤，刘贵河

(1.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070;2.河北北方学院动物科技学院，河北 张家口 075000)

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性加重的呼吸困难、难治性低氧血症和肺水肿，严重时称为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。致病因素包括严重感染败血症、创伤、中毒、大量输血、体外循环和弥漫性血管内凝血等，其中以严重感染最为常见［1］。ALI是流感病毒感染哺乳动物的主要症状之一，但其确切发病机理并不很清楚，近年来对其机理的研究主要集中在细胞因子和炎症介质的作用上。我们选择H9N2猪流感病毒(H9N2－SIV)诱导小鼠 ALI过程的不同时期，检测致炎细胞因子白介素－1β (interleukin－1β，IL－1β)、白介素－6(interleukin－6，IL－6)［2］以及抗炎细胞因子白介素－10(interleukin－10，IL－10)的含量，从细胞因子水平分析探讨这些炎症因子在H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠ALI发生、发展中的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

猪流感病毒A/swine/HeBei/012/2008(H9N2)由本课题组分离，河北北方学院动物科技学院预防兽医学实验室保存;采用鸡胚尿囊腔接种法扩增病毒，每只胚接种0.1 mL，孵化72 h，收获供研究用病毒。

6～8周龄 SPF级 BALB/c雌性小鼠80只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司［SCXK(京)2009－0004］。动物实验在中国人民解放军251医院三级生物安全实验室进行［SYXK(军)2007－018］，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

小鼠 TNF－α ELISA 试剂盒、小鼠 IL－1β ELISA试剂盒、小鼠IL－6 ELISA试剂盒和小鼠IL－10 ELISA试剂盒，博士德生物工程有限公司。

其他实验药品均为分析纯，试剂由课题组自配。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组与感染

进鼠前，将鼠笼用紫外线照射12 h消毒，同时对动物室进行全面消毒，饲料、饮水高压消毒。所有小鼠均在已消毒的动物室中隔离饲养，采取自由饮水和采食，适应性喂养一周。

80只小鼠随机平均分成实验组和对照组，实验组用灭菌生理盐水5倍稀释的含有H9N2亚型猪流感病毒(H9N2－SIV)的鸡胚尿囊液经鼻腔接种小鼠，接种剂量为每只0.1 mL(约含1×103MLD50)。对照组小鼠采取相同途经接种0.1 mL的经灭菌生理盐水5倍稀释的正常鸡胚尿囊液。具体造模方式参照文献［3］。

1.2.2 标本的采集

接种开始前的时刻记为 0 d，分别在 2、4、6、10、14 d两组各随机抽取5只小鼠，实施安乐死，迅速剥离肺组织，立即用无菌冷生理盐水漂洗去表面血污，滤纸吸干，称重后放在匀浆器口部，用眼科剪剪成碎块，加入9倍重的冷生理盐水将剪碎肺组织冲入匀浆器中，在冰浴中充分研磨匀浆。将肺组织匀浆液3000 r/min 4℃离心15 min，取上清液，置 －80℃冻存待测。

1.2.3 标本的检测

酶联免疫法(双抗体夹心ELISA法)操作流程严格按照试剂盒说明书进行。终止反应后，将酶标板放入酶标仪槽内，选择450 nm波长进行检测，记录结果，单位为ng/mL。

1.2.4 数据处理

将所有检测样本(测定值为光密度)换算成浓度单位，实验数据统计分析实验数据以()表示，SPSS 13.0统计软件包进行t检验(independent sample t test)，P＜0.05判为差异有显著性，P＜0.01为差异非常显著。

2 结果

与对照组比较，实验组各时间点肺组织匀浆中TNF－α、IL－1β、IL－6 和 IL－10 浓度均显著高于正常对照组(P＜0.05)(图1)，两组肺组织匀浆中 TNF－α、IL－1β、IL－6 和 IL－10 的浓度变化见表 1。TNF－α 和IL－1β在损伤后第2天急剧升高，第4天达到高峰后开始下降，至14 d后趋于正常;IL－6及IL－10于损伤后第2天开始升高，至第6天达到高峰，第10天虽然有所下降，但下降幅度不大，到14 d仍高于正常对照组。

图1 肺组织匀浆中炎症因子浓度均值的比较Fig.1 Comparison of the mean concentrations of inflammatory factors in the lung tissue homogenates

表1 肺组织匀浆中炎症因子浓度的变化(，n=5，ng/mL)Tab.1 Changes of the concentrations of inflammatory factors in the lung tissue homogenates(，n=5，ng/mL)

表1 肺组织匀浆中炎症因子浓度的变化(，n=5，ng/mL)Tab.1 Changes of the concentrations of inflammatory factors in the lung tissue homogenates(，n=5，ng/mL)

注:与对照组相比，*P ＜0.05，ΔP ＜0.01。Note:Compared with the control group，*P ＜0.05，ΔP ＜0.01

炎症因子浓度的变化Changes of concentration of inflammatory factors TNF－α IL－1β IL－6 IL－10对照组 control group 25.76±6.52 28.28±5.28 19.35±8.17 80.57±12.25组别Groups实验组Infected group 2 d 40.31±8.31* 42.81±8.63* 23.26±10.23* 103.73±18.52Δ 4 d 44.70±13.62Δ 44.21±12.14Δ 24.81±10.72Δ 141.73±20.15Δ 6 d 41.81±9.17Δ 43.59±11.92Δ 32.35±12.57Δ 145.73±15.71*10 d 33.48±5.15* 34.96±6.21* 31.04±8.64Δ 123.07±11.32*14 d 31.59±6.07* 31.53±4.11* 25.81±7.87* 103.40±11.87Δ

3 讨论

既往研究表明:流感病毒感染可波及肺间质和肺泡而引起肺炎，细胞因子在其发病过程中发挥重要作用［4］。病毒感染后通过细胞因子的诱导作用，激活内皮细胞和粒细胞，继而调节黏附分子的合成及其在细胞表面的表达［5］。

TNF－α是介导ALI的主要细胞因子。TNF－α能够诱导肺内皮细胞活化、白细胞迁移、粒细胞脱颗粒和毛细血管渗漏，积聚的水肿液进一步阻碍了肺泡细胞的灌流和氧气交换，引起 ARDS。此外，TNF－α还可与多种细胞因子相互联系，产生广泛作用，如TNF－α与IL－1产生协同作用，激活肺部炎性细胞的核因子 κB，诱导产生多种细胞因子(如 IL－6、IL－8、干扰素 γ、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子、转化生长因子 β 等)，启动炎症级联反应［6］。IL－1β 可以刺激多种趋化因子的产生，如IL－8、上皮细胞来源的中性粒细胞趋化物、单核细胞趋化肽以及巨噬细胞炎性趋化肽1α等，所以它在 ALI/ARDS时的炎性级联反应中占有主导位置［7］。尽管有研究指出，在ALI/ARDS中IL－1β还参与了损伤的肺泡上皮的修复［8］;但长期大量实验研究显示其仍以促炎作用为主，修复作用还有待进一步研究。IL－6是机体创伤和修复过程中一种重要的急性期反应介质，在创伤和炎症过程中，具有双重作用，既有致炎作用又有抗炎作用［9］。有报道称其在不同情况下可发挥炎症因子或抗炎因子的作用，但在急性肺损伤中IL－6是炎症因子还是抗炎因子尚未明确［10］。IL－10是机体重要的一个抗炎因子，抑制某些促炎因子(IL－1β、TNF－α、IL－6、IL－8 等)的产生，防止机体发生继发性的组织损伤［6］。

本实验结果显示，在H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠ALI发生、发展过程中，炎症因子相互诱导、相互协同，发挥着极其重要的作用:TNF－α、IL－1β 起致炎因子的作用，含量迅速增加，引起局部炎性反应和器官的损害;IL－6在各时间点均明显增加，随着ALI时间的延长，其含量有逐渐增加趋势，与抗炎因子IL－10有相同趋势，说明 IL－6在本实验中可能发挥抗炎的作用，这还有待于进一步的研究。IL－10起抗炎因子的作用，与 TNF－α、IL－1β 比较，其含量增加较缓，但持续增加时间长，而且下降时间较晚，说明 IL－10 是在 TNF－α、IL－1β 发挥作用后，才诱导其大量释放，同时也说明 IL－10在 ALI的转归过程中发挥重要作用。

［1］徐金富.肺部感染相关急性肺损伤发病机制研究进展［J］.国外医学呼吸系统分册，2004，24(2):72－75.

［2］Davies MG，Hagen PO.Systemic inflammatory response syndrome［J］.Br J Surg，1997，84(7):920 －935.

［3］魏东，刘英，徐彤.H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠动物模型的建立［J］.中国实验动物学报，2012，20(5):55－58.

［4］孙惠惠，邓巍，占玲俊，等.板蓝根颗粒对甲型流感病毒小鼠的作用［J］.中国比较医学杂志，2010，20(7):54－57.

［5］鲍琳琳，孙惠惠，占玲俊，等.甲型 H1N1流感病毒感染小鼠的发病机制［J］.中国比较医学杂志，2011，21(2):20－22.

［6］马丽梅，郑春兰，马加庆.急性肺损伤与细胞因子相关性的研究进展［J］.医学综述，2009，15(19):2909－2912.

［7］王占海，沈凌鸿，陈向东，等.水飞蓟素对脂多糖性大鼠急性肺损伤的拮抗作用［J］.中国病理生理杂志，2007，23(2):280－283.

［8］Ware LB，Matthay MA.The acute respiratory distress syndrome［J］.N Engl J Med，2000，342(18):1334－1349.

［9］Proctor MC，Sullivan V，Zajkowski P，et al.A role for interleukin－10 in the assessment of venous thromboembolism risk in injured patients［J］.J Trauma，2006，60(1):147 －151.

［10］McAlister V，Gao Z，Peltekian K，et al.Sirolimus－tacrolimus combination immunosuppression.Lancet，2000，355:376－377.