四种抗肝癌中药对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响

孙悦文 梁 钢 唐燕霞

广西医科大学，广西南宁 530021

肿瘤的发生需要微小血管的增生与灌流提供营养，异常的血管生成是肿瘤的一个明显特征，因此，如何抑制肿瘤血管生长已经成为抗肿瘤药物研究的一个非常重要的方向[1]。目前已发现有多种中药可通过增强VEGF的表达促进血管的生成[2]，同时也利用CAM模型发现了多种中草药的抑制血管生成作用[3]。索拉菲尼可以通过上游抑制酪氨酸激酶受体VEGFR和PDGFR而达到抑制血管生成的作用[4]，破骨风性平，可祛风除湿，活血散瘀，消肿止痛[5]；天胡荽性凉，有小毒，利湿止咳，凉血止血[6]；土半夏性温，味辛，有毒，燥湿化痰，和胃健脾，有抗凝血作用[7]；血党性平，无毒，有活血调经，补血止血，利咽消肿的功效[8]。以上药物均具有血液血管相关的功效，为分析其作用，本文以索拉菲尼为阳性药，采用鸡胚绒毛尿囊模型观察药物对血管生长作用的影响，探讨药物对血管生成的作用，研究药物可能存在的酪氨酸蛋白激酶抑制作用的靶向性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 鸡胚 共144枚，购自南宁市良凤农牧有限责任公司。

1.1.2 药物 破骨风、土半夏、血党、天胡荽购自广西桂林市腾龙堂药业有限责任公司同心园药店；上述中药均经过广西中药研究所鉴定并确认。索拉菲尼购自拜耳公司，片剂，200 mg/片，批准文号 H20060296。

1.1.3 仪器与试剂 CO2培养箱（美国Thermo公司），倒置相差显微镜（日本OLYMPUS公司），Hfsafe 1200安全柜（香港热力发展有限公司），LDZX-50FBS立式高压灭菌器（上海申安医疗器械厂），乙醇（购自成都市科龙化工试剂厂）。

1.2 方法

1.2.1 药材的提取

1.2.1.1 药材的选择、提取与萃取 醇提：将药材泡在约5倍体积75%的乙醇溶液中，回流提取2 h，得到滤液；重复1次；合并两次药液，过滤，浓缩至浸膏，移入干净的瓶中备用。

1.2.1.2 药物的浓度配置 鸡胚实验：索拉菲尼配成25 mg/mL[9]，各药物配成50 mg/mL，对半稀释2次得到3个浓度，得到索拉菲尼浓度：25 mg/mL，12.5 mg/mL，6.25 mg/mL；四种中药浓度：50 mg/mL，25 mg/mL，12.5 mg/mL。各药物在安全柜中0.22 μm微孔滤膜过滤，保存于-4℃。

1.2.2 假气室的制备及加药

取7日龄鸡胚随机分为给药组和空白组，每组9枚。75%酒精棉球擦洗两遍消毒，鸡蛋气室向上，长托与蛋托呈 45℃，放入温度（37.0±0.5）℃，相对湿度 60%的 CO2培养箱中孵育。第2天，于超净工作台在气室上方蛋壳处敲破蛋壳，用眼科镊开1.5 cm×1.5 cm窗口，暴露下方的卵壳内膜，将预先剪成直径5mm的灭菌定性滤纸[10]圆片放在CAM上较少血管处，实验组加入100 μL不同浓度药物，空白对照组加入100 μL氯化钠注射液。然后用灭菌的透明胶纸封闭卵壳开口，继续放入培养箱中孵育[11]。

1.2.3 CAM标本的制作

加药孵育 48 h 后，加入甲醇∶丙酮（1∶1）的固定液 1.5 mL，室温下固定15 min，待CAM的血管完全凝固后，用眼科镊去掉CAM平面以上的卵壳和卵壳膜，并用眼科剪以滤纸载体为中心，完整剪下CAM，置盛有蒸馏水的碟皿中，用眼科镊舒展CAM，将其平铺于载玻片上。阴干。在显微镜下（×40）观察血管生长情况。血管计数记录以载体为中心，半径5 mm内的血管数。用倒置显微镜观察出大、中、小血管的粗细，计数。根据血管直径将血管分为三类：（1）＞0.2 mm为一级血管；②＞0.05 mm且＜0.2 mm为二级血管；（3）＜0.05 mm为三级血管。

1.2.4 统计学处理

用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。计量资料以（x±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

与空白对照组相比，索拉菲尼组、破骨风组均能使鸡胚的二、三级血管减少（P＜0.01），土半夏组，血党组能抑制鸡胚三级血管的生长（P＜0.01），并且其高剂量组也能够抑制二级血管的生长（P＜0.01）。其中，索拉菲尼组对二三级血管的抑制呈现剂量依赖性 （高低剂量对比，P＜0.01），破骨风组对三级血管的抑制呈现剂量依赖性（高低剂量对比，P＜0.01），高剂量组对二级血管的抑制率与中低剂量差异有统计学意义（P＜0.01）；血党组与土半夏组对三级血管的抑制也呈现剂量依赖性（P＜0.01）；天胡荽虽高剂量对三级血管生长有一定抑制作用但是抑制作用较弱。具体见表1。各药物组对大血管的生长均有影响，因大血管数量少故不做统计学分析。

3 讨论

血管生成是指从母血管发芽生成出新的微小血管，在实体瘤的生长和转移过程中，微血管起着至关重要的作用[12]。因此，通过抑制肿瘤组织的新血管形成可以抑制肿瘤的生长、转移。

在研究血管生成领域，CAM是一个比较成熟经典的模型。鸡胚在孵育的第3~5天和第7~10天血管生长最为活跃，第12天以后血管渐渐开始萎缩，因此，8天~12天是药物作用的最好时期[13]。

在本实验中可以看到，各药物组对一级血管的生长也有一定影响，各药物均能减少一级血管的均数，其中以土半夏与破骨风作用最强。提示药物对鸡胚主血管的发生也有一定影响。

表1 不同药物组对鸡胚CAM血管生成的影响（x±s）

在本实验中可以看到索拉菲尼与破骨风对血管有明显的抑制作用，同时，土半夏组与血党组亦表现出一定的抑制作用，提示其中可能含有能抑制血管生长的成分，并有可能通过与索拉菲尼同样的信号传导途径实现这一抑制作用。

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