猪实验性心房颤动模型心房重构及替米沙坦干预的影响*

徐晤，王志荣，李思召，张超群，李飞，周召峰，张卓琦

心房颤动是常见病和多发病，严重危害着公众健康，花费较多[1]。目前心房颤动的药物治疗不尽理想，对于心房颤动发生和预防的研究，具有很重要的临床意义。心房颤动时存在的心房重构包括电重构和结构重构，同时伴有肾素－血管紧张素系统(RAS)的激活[2]。本实验通过快速右心房起搏构建猪的心房颤动模型，观测心房颤动时心房结构重构和心房肌组织中胶原蛋白-I和血管紧张素转换酶2（ACE2）的表达及其变化，探讨它们之间的关系。

1 材料与方法

实验动物:实验时间2010-01至2011-06，健康小型家猪18只，雌雄不限（所有的动物均由徐州医学院动物实验中心提供），3～4个月龄，体重（37.4±2.5）kg。先行编号，按随机数字表随机均分成3组，每组6只:正常对照组，植入电极不起搏；快速起搏组，植入电极并快速右心房起搏；替米沙坦组，快速右心房起搏并给予替米沙坦60mg/（kg·d）喂养。

模型制备:本实验参考Chen等[3]采用的方法并加以改良以快速右心房起搏建立心房颤动模型。简述之，以3%戊巴比妥钠麻醉，采用Seldinger血管穿刺技术穿刺右侧颈内静脉，3组植入心房单极起搏电极(美国Medtronicstreamline)，用起搏分析仪测量起搏参数满意（电压阈值＜1 V，阻抗500～1000 Ω）后，连接实验高频心脏起搏器并埋置于右侧锁骨上区。

参数设定:起搏方式为AOO，脉冲频率520次/分，脉冲幅度≥5 V，脉冲宽度0.15 ms，经磁铁启动并测试满意后埋置起搏器。术后予头孢唑啉钠3.0 g肌肉注射抗感染4天，每日观察猪的进食进水情况，特别注意起搏器植入部位有无渗血、血肿、皮肤破溃。持续起搏2周，每周记录一次标准肢体导联心电图检查起搏状态。

心房颤动的诱导及持续时间的观察:各组于实验开始及2周结束时均行电生理检查:经高位右心房电极行期前程序刺激和短阵快速（Burst）刺激进行心房颤动的诱发。①期前程序刺激的驱动周长(S1S1)为300 ms，S1S2间期为心房有效不应期加上50 ms，步长5 ms反扫直至不应期。如果不能诱发心房颤动则引入S3， S2S3间期从S1S2的80%开始，步长5 ms反扫直至S3落入不应期，若仍不能诱发心房颤动则引入S4。②若S4也未能诱发心房颤动，则采用12 Hz，脉宽2 ms， 4倍阈值的短阵快速刺激（l0 s）诱导，记录刺激时心房颤动诱发的情况及持续时间。参照既往文献[4]，把持续时间大于15 min的心房颤动定义为持续性心房颤动。如果实验过程中出现持续不能自行终止的房性心动过速或心房颤动，观察45 min后如不能自动恢复则进行电转复，复律后暂停30 min再重新进行刺激。

超声测量猪心室收缩末期左心房面积（LAESA）、右心房面积（RAESA）:检查前用磁铁关闭起搏器，使用便携式超声机（Philips，美国），探头的频率为2～4 MHz，分别在起搏前及起搏2周后采用面积—长度法测量LAESA、RAESA，测量参数取3个心动周期的平均值。

形态学观察:取猪心肌组织数块，置10%中性福尔马林溶液固定，梯度酒精系列脱水， 常规石蜡包埋，切成5 μm厚，并行苏木素伊红（HE）染色、马松（Masson）染色和免疫组化染色。按照公司试剂说明操作，光镜下观察心肌细胞形态、胶原纤维及其ACE2，拍片，扫描，采用图像分析仪定量心肌组织胶原及ACE2含量。

ACE2和胶原蛋白-I的蛋白质印迹法（Westen blot）检测:100mg心房肌组织加0.5ml裂解液，超声粉碎后匀浆，离心后lowry法测蛋白浓度。取40 μg总蛋白聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳（80 V 20～30 min，120 V 1～1.5 h），转膜（10 V，1.5 h），封闭非特异抗原，分别加入胶原蛋白-I和ACE2抗体4℃过夜，再加二抗37℃ 2 h；漂洗、显色、光密度扫描分析光密度，分别计算ACE2和胶原蛋白-I相对含量。

获得的目标蛋白条带OD值与内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）条带OD值相比获得数据。GADPH是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30～40 KD的亚基组成，分子量146 KD，检测条带大约在36 KD。

统计学方法:使用SPSS 16.0统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组内的前后比较用配对的t检验；多组比较采用单因素方差分析（ANONA），组间的两两比较用q检验（SNK法），两计量资料相关性检验采用Pearson相关分析；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 猪心房颤动模型的建立及心房颤动的诱发

起搏前，3组猪程序刺激和Burst（500次/分）刺激均未诱发出心房颤动。快速起搏组和替米沙坦组快速起搏2周后关闭起搏器，快速起搏组有1只猪表现为持续的心房颤动，另外5只猪用程序刺激或Burst刺激均可诱发出心房颤动，心房颤动诱发率为100%，快速起搏组有5只猪可诱发超过15 min的心房颤动，平均时间（26.41±9.89）min。替米沙坦组有4只猪诱发出＜15 min的心房颤动，平均时间（9.57±2.50）min，2只猪未诱发出来心房颤动；替米沙坦组与快速起搏组比较心房颤动持续时间缩短，差异有统计学意义（P=0.01）。正常对照组诱发情况同术前无变化。

2.2 起搏前后心脏超声结果（表1）

表1 实验前后各组心脏超声结果(mm2，)

表1 实验前后各组心脏超声结果(mm2，)

注:与正常对照组比较＊P＜0.05，与快速起搏组比较△P＜0.05，与同组起搏前比较▲P＜0.05

组别 心室收缩末期左心房面积 心室收缩末期右心房面积起搏前 起搏2周后 起搏前 起搏2周后正常对照组 569.8±16.6 572.4±17.1 495.5±19.9 498.7±18.3快速起搏组 573.1±14.9 744.3±29.9＊ 497.9±12.2 677.9±26.3＊替米沙坦组 571.4±21.1 630.6±10.9＊△▲ 499.1±29.3 553.4±13.7＊△▲只数666

起搏前后使用美国SONOHEART便携式超声机测量LAESA、RAESA。起搏前，3组LAESA和RAESA分别比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)；起搏2周后，快速起搏组和替米沙坦组LAESA和RAESA均较正常对照组大（P＜0.05），替米沙坦组LAESA和RAESA均较快速起搏组缩小（P＜0.05），替米沙坦组LAESA和RAESA起搏2周后较起搏前增大（P＜0.05），差异均有统计学意义。

2.3 形态学观察

猪右心房组织形态学观察结果:苏木素伊红染色（图1）显示，快速起搏组心肌细胞排列紊乱，组织结构破坏，可见明显的间质纤维化。替米沙坦组较快速起搏组明显好转，心肌细胞排列较规整，细胞核较规则，可见少量纤维组织填充。马松染色（图2）显示，替米沙坦组心房肌组织胶原阳性染色较快速起搏组明显减少，主要位于血管周围和心肌细胞间质。

2.4 血管紧张素转换酶2免疫组化染色（图3）

图1～3 猪右心房组织形态学观察结果。1为苏木素伊红染色 2为马松染色 3为血管紧张素转换酶2免疫组化染色。A为正常对照组 B为快速起搏组 C为替米沙坦组

正常对照组心房肌ACE2阳性颗粒较多，快速起搏组心房颤动心房肌阳性染色明显减少，替米沙坦组予替咪沙坦干预后心房肌ACE2阳性颗粒明显增多。

2.5 血管紧张素转换酶2和胶原蛋白-I 的蛋白质印迹法结果

快速起搏组ACE2含量明显低于正常对照组、替米沙坦组（P＜0.05），差异均有统计学意义（图4）。快速起搏组胶原蛋白-Ⅰ含量明显高于正常对照组、替米沙坦组（P＜0.05），差异均有统计学意义（图 5）。

图4 、图5 蛋白质印迹法结果。4为血管紧张素转换酶295 KD 5为胶原蛋白-I 90 KD。A为正常对照组 B为快速起搏组 C为替米沙坦组

2.6 Pearson 相关分析

RAESA与胶原蛋白-I呈正相关（r=0.956，P＜0.01），RAESA与ACE2、ACE2与胶原蛋白-I均呈负相关（r=-0.966，r=-0.948，P＜0.01），差异均有统计学意义。

3 讨论

通过快速右心房起搏建立持续性心房颤动模型。既往有应用乙酰胆碱等药物及造成二尖瓣反流等建立的心房颤动模型，但不能模拟心房颤动真实发病过程及特点。本实验以Chen等[3]的方法为基础加以改良，采用闭胸法通过快速右心房起搏建立持续性心房颤动猪动物模型，更接近心房颤动的病理生理状态。右心房以500次/分的起搏频率起搏2周后，观察到1只猪出现持续性心房颤动；经程序刺激或Burst刺激，心房颤动诱发率可达100%，其中快速起搏组83.3%的猪可诱发出持续时间＞15 min的心房颤动。该方法操作简便、成功率高、可重复性好，为进一步实验奠定了基础。

心房颤动时心房病理形态学变化及结构重构。在没有电重构、心房扩张和心力衰竭的情况下，单纯的心房纤维化足以促进心房颤动的发生[5]。贾红丹等[6]发现风湿性心脏病伴慢性心房颤动患者心房结构重构以心肌纤维化为主要特征，心房颤动患者左、右心房血管紧张素Ⅱ受体表达不平衡，且较窦律者组有升高趋势。本实验病理形态学显示，心房颤动模型心肌细胞排列紊乱，组织结构破坏，可见明显的间质纤维化以及脂肪组织浸润，间质胶原沉积，各型胶原比例失调和排列紊乱，这些病理学改变为心房颤动的发生和持续提供了病理生理方面的物质基础，快速心房起搏会导致心房的进行性扩大。

心房颤动时肾素-血管紧张素系统的激活及心房纤维化，替米沙坦干预对心房颤动时心房结构重构的影响。肾素-血管紧张素系统激活在心房颤动心房间质纤维化的发生中起重要作用[7]。在心肌梗死后的心室肌内，血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1）受体阻滞剂氯沙坦、奥美沙坦恢复了血管紧张素Ⅱ1型受体的正常表达，同时增加了ACE2的表达[8]。ACE2的表达能部分抵抗血管紧张素 II诱导的心肌肥厚和纤维化[9]。我们前期研究结果示[10]:替米沙坦可提高慢性心房颤动心房ACE2的表达，抑制慢性心房颤动的心房纤维化。本结果显示猪经过快频率心房起搏2周后，心房颤动的诱发率显著增加，并且持续时间明显延长；病理学证实发生了明显间质纤维化。快速心房起搏诱导的猪心房颤动模型的心房组织的ACE2表达下降可能是导致胶原蛋白-I表达增加、心房纤维化的重要机制之一。替米沙坦能有效降低心房纤维化，抑制猪慢性心房颤动模型结构重构的发生，进而为替米沙坦治疗心房颤动提供了新的理论依据。

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