一种来源于植物内生真菌次级代谢产物的抗肿瘤活性研究

胡淑媛 罗都强 陈 川

1.河北大学生命科学学院，河北 保定 071000；2.河北大学药物化学与分子诊断重点实验室，河北 保定 071000；3.河北大学生命科学学院，河北 保定 071000

天然产物及其衍生物一直是宝贵的化学预防和治疗药物的来源，它们主要来源于微生物，植物和动物体内的组成成分或其代谢产物。最近从植物内生真菌中分离的天然产物引起了人们的重视。细胞凋亡是一个受到严格控制的自我毁灭的过程，维持着细胞的动态平衡。细胞凋亡信号转导通路的异常，这导致的癌症的发生。促进细胞凋亡和抑制癌细胞增殖的化合物，被认为是潜在的抗癌药物。

DMMP (4-(3'，3'-dimethylallyloxy)-5-methyl-6-methoxyphthalide) 最早分离自葱链格孢（Alternaria porri），结构见图1。杨小龙等人从植物内生真菌石楠拟盘多毛孢菌（Pestalotiopsis photiniae）中同样也分离到，并发现有一定的抗真菌活性[1]。我们分离得到DMMP并对其抗肿瘤机制进行了研究发现，DMMP可以抑制HeLa的增殖并诱导其凋亡。

图1 DMMP的结构

1 实验材料及方法

DMMP由本实验组分离得到（纯度＞ 99%，HPLC 纯），人宫颈癌细胞系HeLa细胞系从中国协和医科大学基础医学细胞中心购买，DMEM细胞培养基（GIBCO）。

1.1 MTT法检测DMMP抗肿瘤活性

对数期的HeLa细胞8000个/·孔接种于96孔板中，37℃、5%C O2培养24h后加入D M S O溶解的D M M P，使其终浓度分别为0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL，80μg/mL。药物分别作用24h、48 h、72 h后，加入20μL 5mg/mL的MT ，37℃、5%CO2孵育4 h，加入100μL 10%SDS-HCl，继续孵育过夜。在酶标仪上于570 nm处读取OD值，计算药物对细胞的抑制率。抑制率=[（OD对照组-OD药物处理组）/OD对照组]×100%。

1.2 DAPI染色检测细胞核形态变化

对数期的HeLa细胞10000个/·孔接种于24孔板中，37℃、5%CO2条件下培养24h，加入DMMP，终浓度为40μg/mL，分别培养12 h，24h。然后除去培养基，PBS洗三遍，4%多聚甲醛固定10min后PBS洗三遍。1µg/mL的DA PI染液避光染色5min，PBS清洗后，于荧光显微镜下观察细胞核形态变化。

1.3 Western blot检测蛋白变化

六孔板内接种5×105个细胞，37℃、5%CO2培养24h，分别用终浓度为0μg/·mL、30μg/·mL、40μg/·mL和50μg/·mL的DMMP处理细胞24h。胰酶消化收集所有细胞，计数。用细胞裂解液（50mm Hepes-NaOH，100mm NaCl，0.5% NP-40，2.5mm EDTA，10% 甘油，1mm DTT，1mm PMSF，0.7μL/mL胃酶抑制剂，0.5μL/mL 亮抑酶肽，2μg/mL 抑肽酶）裂解细胞后，12000 rpm、4℃离心15min，取上清，得总蛋白。利用Bradford法做蛋白浓度标准曲线，测出样品蛋白浓度。上样50μg总蛋白，进行Western印记，检测P73、P27的蛋白变化，GAPDH蛋白作为内参。

1.4 实时荧光定量PCR（Real time PCR）检测相关基因mRNA水平的变化

六孔板内接种5×105个细胞，37℃、5%CO2培养24h，用40μg·/mL DMMP分别处理细胞0 h、12 h、24h和36 h。处理后的所有细胞，Trizol 处理提取总RNA。测定总RNA的量，然后将R NA定量进行反转录得到cDNA。利用cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，检测不同基因的变化，以GAPDH基因为内参，每组做3个平行。所得数据利用ΔΔCT方法计算基因表达量的变化。

2 实验结果

2.1 DMMP抑制HeLa细胞增殖

DMMP对HeLa的抑制率结果见图2A。不同时间的IC50分别为24h：36μg/mL；48 h：22μg/mL；72 h：13μg/mL，随着药物浓度的升高，抑制率不断升高。结果证明DMMP抑制HeLa细胞增殖具有剂量和时间依赖性。

图2 DMMP抑制HeLa细胞增殖

DM M P处理HeLa细胞后， DA PI荧光染色见图2B，处理12h后细胞核出现染色质浓缩，细胞核碎裂，被染成大小不一、致密浓染的颗粒，证明开始有细胞凋亡；处理24h后凋亡小体数目增多。

2.2 不同药物浓度的处理后P73，P27蛋白的变化

P27是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，可使细胞周期停滞于G1期，从而抑制细胞增殖。经不同药物浓度处理HeLa细胞，发现P27蛋白的表达量有一定的升高。P73是抑癌基因蛋白P53的类似物，能转录激活几乎所有P53的调节基因，与细胞的凋亡相关。DMMP能显著地增加P73蛋白的水平。见图3。

图3 不同药物浓度的处理后P73、P27蛋白的变化

2.3 DMMP处理后p73，JunB，p16，FKHR，Bim的mRNA表达水平

JunB是一种p73调节基因，通过诱导细胞周期蛋白依赖性激酶CDKs（Cyclin-dpendent kinase）抑制剂p16来抑制细胞的增殖。经DM M P不同时间处理HeL a细胞后，发现p73的m R NA在36 h显著增加，是对照的2.6倍。JunB的mRNA在药物处理12 h就显著升高并且逐步升高，到36 h时是对照的7.6倍，见图4。p16的mRNA在12 h时开始增加，24h是对照的4.6倍，随后回落到对照的2.2倍，具有显著差异。

图4 p73、JunB、p16、FKHR和Bim的mRNA表达水平

表1 Real time PCR中用到的引物

FKHR（The FOXO family of Forkhead transcription factors 1，FOXO1）受PI3K/Akt 通路的调节，对某些促凋亡基因如Bim有调节作用，进而诱导细胞凋亡。DMMP能显著的增加FKHR的mRNA水平，在12 h时达到最高3.3倍。Bim的mRNA变化趋势与FKHR及其相似，都是在12 h时有显著升高。

3 讨论

使用DAPI染色分析发现DMMP可以诱导HeLa细胞出现典型的细胞凋亡形态，如细胞浆浓缩，细胞体积缩小；细胞核固缩进而断裂为大小不一的片段，细胞变成数个凋亡小体。

细胞周期进程是由CDKs所触发的，它除了受Cyclins正向调节外，还受到另一类蛋白质的负向调控，这类蛋白称为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CKIs（CDK inhibitors），可分为两类一类是INK4的家族（p16INK4a的，P15INK4B，p18INK4c和p19INK4d的），第二类是CIP/ KIP家族（p21CIP1和p27KIP1）。DM M P处理HeLa细胞后，p27KIP1蛋白和p16IN K4a的m R NA的水平的升高。

DMMP处理后能显著的增加P73蛋白的表达，我们随后对其mRNA和其调控基因JunB进行了分析。JunB是p73的一个靶基因，是增殖的负调节因子，它已被证明在成纤维细胞中诱导p16的转录。失去JunB表达的转基因小鼠出现慢性髓性白血病，表明在髓样细胞中JunB是一种肿瘤抑制基因[2]。在我们的实验中发现DMMP处理后p73，JunB和p16的mRNA水平都有不同程度的升高，说明p73-JunB-p16通路可能与DMMP诱导的细胞周期阻滞相关。

叉头转录因子FKHR（FOXO1）在细胞内主要受PI3K/Akt的负向调控，过表达F K H R可以诱导细胞周期阻滞和凋亡。FKHR可以转录激活P27蛋白而使细胞周期停滞在G1期。其促凋亡作用可以通过转录激活FasL、Bim和Bcl-6等促进凋亡的蛋白来实现[3]。在实验中发现，药物处理后P27蛋白表达有一定的增高。定量PCR发现FK HR的m R NA水平在DM M P作用后有显著的升高，并且其调控的Bim基因的表达也有显著的增加。Bim是唯BH3域蛋白（BH3-only proteins），在凋亡的启动及凋亡通路中发挥着极其重要的作用。Bim可以直接与Bax等相互作用并共同转位到线粒体膜上引起细胞色素C释放而诱导凋亡。DMMP能引起Bim的mRNA增多，这提示着DMMP可能通过线粒体途径诱导细胞凋亡。有报道发现P73能够调节Akt-FKHR-Bim 通路并诱导细胞凋亡。P73与Akt- FKHR-Bim通路的作用是否与DMMP诱导细胞凋亡有关还需要进一步实验研究。

总之，DMMP能显著的抑制HeLa细胞的生长，其作用机制可能与其上调p73和FKHR转录因子导致JunB，p16，FKHR和Bim基因的mRNA增高相关。

[1]Yang XL，Zhang S，Hu QB，et al.Zhang Y（2011）Phthalide derivatives with antifungal activities against the plant pathogens isolated from the liquid culture of Pestalotiopsis photiniae[J]. JAntibiot（Tokyo），64：723.

[2]万虹，石原弘.X射线照射诱导小鼠junB基因的表达[J].中华放射医学与防护杂志，2004（4）：309-321.

[3]Boudewijn M.T.Burgering and Geert J.P.L.Kops.Cell cycle and death control：long live Forkheads TRENDS in Biochemical Sciences，2002，27（7）.