SYBR GreenⅠ染料法定量PCR检测疟原虫感染及鉴别虫种的临床应用

陈江涛 刘配芬 钟德善 潘雪峰 杨辉 杨立业 陆志为 杨惠钿 林敏★

Santiago-m Monte-Nguba6 Juan Carlos Salas Ehapo6 Urbano Monsuy Eyi6

疟疾是严重危害人类健康和生命安全的疾病，同结核病、艾滋病一起被WHO列为当前危害最为严重的三大传染病。目前，全球仍有近100个国家和地区流行疟疾，全球约40%人口受到感染威胁，每年有2亿多人感染疟疾，约65.5万人死于疟疾[1,2]。寄生人体的疟原虫有4种，即间日疟原虫（Plasmodium vivax）、三日疟原虫（Plasmodium malariae）、卵形疟原虫（Plasmodium ovale）和恶性疟原虫（Plasmodium falciparum），其中恶性疟原虫致病性最强，死亡率最高，是目前地球上对人类危害最严重的蚊媒寄生原虫病。疟疾流行最严重的地区为非洲撒哈拉沙漠以南，拉丁美洲和东南亚地区，其中，约85%的疟疾发病和91%的死亡病例出现在非洲，因此疟疾在非洲许多国家被称为“头号杀手”[2]。随着我国经济发展，国力增强，我国援非项目以及国际交往增多，许多到非洲工作的人员感染疟疾的机会变得越来越高[3]。

疟疾的快速诊断和早期治疗是其防治的关键，但目前对于疟疾诊断的手段较为落后，多采用胶体金检测疟原虫抗原或者显微镜镜检，敏感性较低，容易在疟原虫密度低的时候漏检[4]；也有少数采用巢式PCR或TaqMan探针法对疟原虫进行检测，但是存在着操作复杂繁琐或者只能对单一虫种进行检测的缺点[5,6]。我们利用一种基于四种疟原虫的小亚基单位核糖体核酸（18S rRNA）共同特征序列为基础设计的可对疟原虫进行定量且做虫种鉴别的实时荧光定量PCR的方法，对非洲赤道几内亚援外医疗队门诊的华人患者进行鉴别诊断。

1 材料与方法

1.1 标本来源

150份血样本采自非洲中国援赤道几内亚医疗队马拉博保健门诊，均为我驻赤道几内亚中资公司的华人，采集疑似患者标本外周血20 μL，滴在903标本采集滤纸上（Whatman-新华公司）干燥后4℃保存备用。同时做血涂片进行吉姆沙染色进行显微镜镜检[8]。阳性质控为以往门诊采集的恶性疟原虫镜检强阳性样本。阴性质控为惠州市中心人民医院常规体检样本20例，且涂片经镜检疟原虫阴性。

1.2 仪器及耗材

LightCycle 480II荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司），MJ mimi型梯度PCR扩增仪（美国Bio-Rad），微量加样器（德国Eppendorf公司），超净工作台（中国苏州精华设备有限公司），干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司），TGL-20B型和TGL-28C-C型台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂），LightCycle 480II荧光定量PCR仪专用96孔PCR板及封板膜（荷兰Bioplastics公司）。

1.3 疟原虫基因组DNA（gDNA）提取

利用自配10%的Chelex-100提取疟原虫基因组DNA，首先剪切0.5×0.5 cm滤纸血斑，加500 μL去离子蒸馏水，震荡30 s，然后静置半小时以上。接着震荡后用13 600 rpm离心4 min，弃上清。加160 μL的10%浓度的Chelex-100，振荡后用56℃孵育2 h，接着98℃变性 8 min，振荡 30 s，13 500 rpm 离心 1 min，然后放置于冰箱4℃冷却半小时以上，备用。

1.4 定量PCR及熔解曲线鉴定虫种

采用以往文献报道的引物[7]：上游引物18S-qF：5'-ATAACGAACGAGATCTTAACCT-3'；下 游 引 物为 18S-qR：5'-ATCGTTCCTCTAAGAAGCTTTA-3'。引物由上海英俊生物技术（广州）公司合成。反应体系总体积20 μL，包括0.2 μL的HotStat DNA聚合酶（大连宝生物工程公司），4 μL的5×PCR buffer（Mg2+plus），1.6 μL 的脱氧核苷三磷酸（dNTP，10 mmol/μL），上述引物各 1 μL（5 μmol/μL），9.2 μL 的双蒸灭菌水，1 μL的SYBR Green I染料（20×，广州东盛生物科技有限公司）和2 μL的上述模板DNA。PCR扩增及熔解曲线分析均在LightCycle 480II 荧光定量PCR仪上进行。PCR扩增参数如下：预变性95℃ 3 min；扩增98℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 20 s，共 36 个循环。熔解曲线鉴定程序如下：95℃ 1 min，40℃ 1 min，熔解曲线数据收集从60℃至95℃，温度上升为1℃/s,且每升高1℃进行5次的数据采集，最终采用仪器软件对Tm值进行分析。

四种疟原虫（间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫和恶性疟原虫）的标准质粒由江苏省寄生虫研究所的曹俊教授构建并赠送给本实验室，该质粒将四种疟原虫的18S rRNA的序列特征的PCR 产物用TA克隆法连接到以pGEM-T载体上。质粒浓度为107copy/mL。我们将该质粒进行梯度稀释（1×107copy/mL，1×106copy/mL，1×105copy/mL，1×104copy/mL）绘制标准曲线，对标本进行定量分析。进行熔解程序后将每例样本的Tm值与标准质粒做对比，可以确定疟原虫的虫种类型。

1.5 定量准确性，敏感度评价

我们按照双盲法，与上海之江生物生产的疟原虫通用试剂盒进行定量准确性的比对，该试剂盒采用PCR结合TaqMan探针技术，引物及探针参照以往文献[9～10]。将传统镜检法与我们的方法进行检出率的比对。将恶性疟原虫质粒按10倍梯度稀释，稀释后溶液分别作为模板，进行荧光定量PCR扩增，确定荧光定量PCR的检测下限，进行灵敏度的评价，稀释后质粒的拷贝数数值如下1×102copy/mL, 5×102copy/mL,1×103copy/mL, 5×103copy/mL, 1×104copy/mL,5×104copy/mL。

1.6 准确性评价

采用Primer premer 5.0软件针对疟原虫的18S rRNA基因设计出四种疟原虫的通用引物如下：rPLU1F: 5'-TCAAAGATTAAGCCATGCAAGTGA-3'；rPLU5R: 5'-CCTGTTGTTGCCTTAAACTTC-3'。按照反应体系总体积50 μL，包括1 μL的DNA聚合酶（广州东盛生物科技有限公司），5 μL的10×PCR buffer（Mg2+plus），4 μL 的脱氧核苷三磷酸（dNTP，10 mmol/μL），上述引物各 1 μL（20 μmol/μL），36 μL 的双蒸灭菌水，2 μL的上述模板DNA。PCR扩增在MJ mimi型梯度PCR扩增仪上进行。PCR扩增参数如下：预变性95℃ 10 min；扩增 95℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 1 min，共40个循环；72℃延伸5 min。产物为1 600 bp，送上海英俊生物技术（广州）公司测序部进行测序，然后将测序结果在NCBI与标准序列进行比对，进行虫种鉴定，以此为金标准与我们的方法进行比较。

1.7 统计学分析

用SPSS16.0软件对数据进行统计分析。采用卡方检验对不同方法学的检出率进行比较，用成对t检验对检测的拷贝数进行比较，若P＜0.05为两者之间存在统计学差异。

2 结果

2.1 定量PCR检测结果及准确性、敏感度评价

150份血样中，我们的检测方法与疟原虫商品PCR试剂盒均检测出阳性样本29例，检出阳性率19.3%，两者之间检出率一致（P＞0.05）。对两个方法学的标本拷贝检测数进行t检验，两者之间无显著性差异（P＞0.05）。两个方法的20例阴性对照组检测结果一致，均为阴性。然而我们发现与定量PCR法不同，对150份样本的镜检仅发现27例阳性结果，阳性率为18%，阳性样本镜检结果见图1。我们对另外2例定量PCR与镜检法存在差异的样本进行分析并对血涂片进行扩大观察范围复检，发现此2例样本的拷贝数均在5×102～1×103copy/mL之间，虫量较少，在扩大观察范围后发现虫体。标准质粒确认该方法的敏感度为最低检测下限为1×102copy/mL至5×102copy/mL之间。

图 1 血涂片中的恶性虐原虫镜检结果（10×100）Figure 1 The results of Plasmodium falciparum in blood smear under microscope(10×100)

2.2 虫种鉴别准确性评价

对四种人体疟原虫定量PCR扩增产物的Tm值进行分析的结果如图2-A所示，四条熔解曲线均为单一的峰，这说明反应中无产生非特异性产物及引物二聚体。四种人体疟原虫扩增产物的Tm值分别为：恶性疟原虫76.5℃（图2-A-a），三日疟原虫78.5℃（图2-A-b），卵形疟原虫 80.6℃（图 2-A-c），间日疟原虫81.7℃（图2-A-d），间隔明显，容易区分不同的虫种。在本次检测中发现的29例阳性样本，经鉴别均为恶性疟原虫。18S RNA基因扩增后电泳切胶回收，测序结果比对，百分之一百一致，产物电泳图如图2-B所示。

3 讨论

疟原虫是严重危害人类健康的世界性疾病之一，80%的病例都发生在非洲。赤道几内亚共和国（The Republic of Equatorial Guinea）位于非洲中西部，西临大西洋，北邻喀麦隆，东、南与加蓬接壤。海岸线长482公里。属热带雨林气候，年平均气温24℃～26℃。赤道几内亚是全世界50个最不发达国家之一，由于热带雨林的气候，国家的卫生、经济条件差，疟疾流行。该国从1970年与我国建交以来，我国长期派驻工程队及医疗队援助该国进行各项建设。由于我国的疟疾流行基本消灭，对于疟疾缺乏抵抗能力，因此我国的工人进驻当地更容易感染疟疾而且症状更为严重。我们知道，疟疾的早期快速诊断对疟疾的治疗是极其重要的，而当地采用的主要是显微镜厚薄血片染色镜检法，该方法费时费力，而且要求专门的镜检设备和技术熟练的镜检员，尤其在原虫血症较低的时候，敏感性差，容易造成漏诊和误诊[4,7]。随着与世界各国之间的交流加强，当地的卫生部门已经拥有各国捐献的荧光定量PCR仪，因此我们考虑采用一种简便，经济，快速的诊断方法去进行疟疾的快速定量及虫种的鉴别。

图 2 四种疟原虫熔解曲线及18S RNA基因PCR扩增结果Figure 2 Melting cures of four kinds of Plasmodium spp and PCR results of 18S RNA gene

从我们的实验结果可知，这种诊断四种疟原虫18S RNA基因的SYBR Green I定量PCR法能够同时对疟原虫进行定量及虫种鉴别。在我们的结果中发现，拷贝数在102～103copy/mL之间的时候，其敏感性优于传统的厚血膜镜检法，不容易漏检。我们将其与我国临床使用的疟原虫通用TaqMan法诊断试剂盒相比，对于这批样本的检出率无统计学差异（P＞0.05），且相对于 TaqMan法，SYBR Green I染料荧光定量PCR技术价格低廉[9,10]，更适合当地的实际情况。与传统的巢式PCR方法相比较，这种方法无需对PCR产物进行凝胶电泳分析，可避免产物引起模板污染；而且采用实时观察反应的方式判读结果，可以在一定程度上避免了传统PCR容易产生的假阳性结果。

从我们门诊的数据显示，我国工人在赤道几内亚感染疟原虫的检出率高达19.3%，这一方面提示我们的驻外工作人员在当地应该做好防蚊的防护工作，另外一方面也说明当地的疟疾流行情况是非常严重的，需要世界卫生组织开展更多的支援工作区控制疟疾的流行。因此，该方法不仅可以对疟疾的早期快速诊断鉴别，而且可以用于抗疟药物疗效的观察与疟疾疫苗使用效果进行评价。因此该方法在当地的使用及推广，有利于赤道几内亚的卫生部门对于疟疾的防控及科研工作的开展。

[1] Snow R W, Guerra C A, Noor A M, et al. The global distribution of clinical episodes of Plasmodium falciparum malaria[J]. Nature, 2005, 434(7030): 214-217.

[2] World Health Organization. World Malaria Report 2010[R].Geneva: WHO Press, 2010: 1-63.

[3] 苑晓冬, 段淑红, 鲍中英. 非洲输入性恶性疟疾104例临床分析[J]. 中国全科医学, 2011, 14(78): 2317-2318.

[4] Hawkes M, Katsuva J P, Masumbuko C K. Use and limitations of malaria rapid diagnostic testing by community health workers in war-torn Democratic Republic of Congo[J].Malar J, 2009, 8: 308.

[5] Sato K, Shinomiya N. Identification of four species of human malaria parasites by fast PCR[J]. Rinsho Byori, 2008, 56(8):657-661.

[6] Katakai Y, Chiabchalard R, Komaki-Yasuda K, et al.Application of real-time polymerase chain reaction (PCR)analysis for detection and discrimination of malaria parasite species in Thai patients[J]. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 2004, 35(Suppl 2): 10-14.

[7] 汪圣强, 周华云, 李宗, 等. SYBR Green I染料法定量PCR用于人体疟原虫定量检测及虫种鉴别的研究[J]. 中国血吸虫病防治杂志, 2011, 23(6): 677-681.

[8] 王羽. 全国临床检验操作规程[M]. 第3版. 南京: 东南大学出版社, 2006: 242-243.

[9] McNamara D T, Thomson J M, Kasehagen L J, et al.Development of a multiplex PCR-ligase detection reaction assay for diagnosis of infection by the four parasite species causing malaria in humans[J]. J Clin Microbiol, 2004, 42(6):2403-2410.

[10] Das A, Holloway B, Collins W E, et al. Species-specific 18S rRNA gene amplification for the detection of P. falciparum and P. vivax malaria parasites[J]. Mol Cell Probes, 1995,9(3): 161-165.

[11] Muhamad P, Chaijaroenkul W, Congpuong K, et al. SYBR Green I and TaqMan quantitative real-time polymerase chain reaction methods for the determination of amplification of Plasmodium falciparum multidrug resistance-1 gene(pfmdr1)[J]. J Parasitol, 2011, 97(5): 939-942.

[12] 欧阳松应, 杨冬, 欧阳红生, 等. 实时荧光定量PCR技术及其应用[J]. 生命的化学, 2004, 24(1): 74-76.