肿瘤基因启动子区异常甲基化与肿瘤的发生

索美芳沈佐君

•综 述•

肿瘤基因启动子区异常甲基化与肿瘤的发生

索美芳1沈佐君2★

肿瘤的发生和发展是一个与多基因、多步骤的致癌因素相关的复杂过程，包括了原癌基因及肿瘤抑制基因的改变、错配修复基因的突变、DNA甲基化和微卫星不稳定性。癌基因的低甲基化与抑癌基因的高甲基化在肿瘤发生、发展中的基因表达调控、基因结构的稳定等方面发挥重要作用。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体,将甲基转移到特定碱基上的过程。甲基化异常被认为是肿瘤的一个特征，是基因组中一种重要的表观遗传修饰，与肿瘤的发生、浸润及转移相关。基因局部甲基化模式的改变已成为令人瞩目的研究领域。本文就DNA甲基化及肿瘤基因启动子区甲基化研究的相关进展作简要综述。

DNA甲基化；甲基转移酶；表皮生长因子受体；启动子

1 DNA甲基化与基因表达调控

1.1 DNA甲基化和甲基化CpG二核苷酸

DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，Dnmt）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上去的过程。高等真核细胞通常是对DNA分子上5'-CpG -3'序列的胞嘧啶进行甲基化修饰[1]。在多阶段癌变过程中，基因表达的异常可能通过基因机制（genetic mechanism）和表观基因机制（epigenetic mechanism）。基因机制是DNA结构发生改变，包括突变和染色体重排；表观基因机制[2]主要指DNA 5-胞嘧啶甲基化改变，引起基因表达异常，而DNA序列及基因产物不变。CpG二核苷酸在人类基因组中占10%，其中70%～80%呈甲基化状态，可称为甲基化的CpG 位点。非甲基化CpG二核苷酸区域仅占基因组的1%～2%。这些CpG二核苷酸以较大的密度分布于基因的5'端，称为CpG 岛[3]。CpG岛碱基长度一般为几百至一千左右，通常位于基因的5'端启动区，也可延伸至基因的外显子区。非甲基化位点随机分布于基因组，通过重新甲基化形成位点、组织和基因特异的甲基化图样。

1.2 DNA甲基转移酶及其表达调控

1.2.1 DNA甲基转移酶

DNA的甲基化修饰是真核细胞基因表达调控的特点之一。首先甲基转移酶与DNA结合，将目标核苷酸反转暴露于DNA双螺旋之外，之后半胱氨酸的亲和基团与胞嘧啶第六位碳（C6）共价结合，从SAM处转甲基至胞嘧啶C5上[4]。通过这种甲基化机制和组蛋白修饰、染色质重组等共同作用， 细胞可以不改变 DNA的碱基序列， 而调控不同基因在不同细胞和组织中的表达。DNA的甲基化是通过Dnmt催化和维持的。哺乳动物的Dnmt有4种，分为两个家族：Dnmt1和Dnmt3。Dnmt1家族[5]在DNA复制和修复中维持其甲基化Dnmt1分子量为 183 kDa， Dnmt1有3个结构域：C端的催化域，N 端的某些蛋白识别的靶区域，以及其他未知区域[4]。有研究表明Dnmt1的半胱氨酸富集区可与未甲基化的CpG岛结合，这说明除了催化区域以外，Dnmt1的其他结构域也与酶活性有重要关系；而Dnmt3家族[6]则催化CpG从头甲基化（denovo methylation）。Dnmt3包括了两个从头甲基转移酶Dnmt3a、Dnmt3b和一个调节蛋白Dnmt3L。Dnmt3a和Dnmt3b的结构域基本相同， 都在N端存在一可变区，可变区之后至C端依次为：PWWP （Proline tryptophan tryptophan proline）结构域， 其可能与DNA非特异性结合有关；半胱氨酸富集的锌结合区域；C端的催化活性区域。Dnmt3L是一种Dnmt3类似蛋白，具有半胱氨酸富集的锌结合区域，缺少C端的酶催化活性域，所以没有单独的催化活性。它是DNA从头甲基化的调节因子[7]，通过与 Dnmt3a和Dnmt3b的C端结合，可提高它们的催化活性， 正向调节 DNA从头甲基化。

1.2.2 DNA甲基化与基因表达调控

一般认为DNA甲基化通过两种途径抑制基因表达。第一种是直接阻碍转录因子与转录调控区结合，直接抑制基因表达；另一种是通过招募DNA甲基结合蛋白（Methyl-CpG-binding proteins，MBP）[8]及一些阻碍复合物，阻止转录因子与特定DNA 序列结合，间接抑制基因表达。p21启动子上的转录因子Sp1结合位点的甲基化并不阻碍Sp1结合到其启动子上，说明第一种途径的抑制作用并不表现在所有基因中。而在第二种途径中，Dnmt和 MBP可与组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase，HDAC）、共抑制子（corepressor）和ATP依赖的染色质重塑蛋白等结合形成抑制复合物，与组蛋白去乙酰化和染色体重塑共同作用，从而抑制基因表达[9]。

2 肿瘤相关基因甲基化的研究

2.1 正常细胞的DNA甲基化

DNA甲基化是一种酶介导的化学修饰过程，在DNA的某些碱基上增加一个甲基。在人类和大多数哺乳动物，DNA甲基化仅影响DNA链上鸟嘌呤前的胞嘧啶[10]，甲基化胞嘧啶是在 DNA复制后形成。因此，在这些生物，DNA甲基化仅发生在CpG位置上。在正常细胞大约70% CpG双核苷酸的甲基化发生在CpG密度比较低的区域。至少在年青人，不管其基因表达状况如何，大多数CpG岛完全无甲基化。然而，这种正常的甲基化发生在大多数基因启动子的外面，它对基因表达的影响仍然不清楚。在某些情况下，甲基化的CpG增加了阻遏因子（Repressor）与DNA的亲和力，而去甲基化可激活基因的表达，也有很多基因过甲基化（启动子外区域），但表达仍很丰富。正常细胞的DNA甲基化的功能尚未完全清楚。多年来，DNA甲基化被认为在多系统中起作用，包括控制基因表达，控制染色体完整性和控制基因重组等。最近认为DNA甲基化进化成为一种防御机制以防止“寄生”DNA序列侵袭基因组，例如逆转录病毒片段等。

2.2 DNA高甲基化

2.2.1 DNA高甲基化产生的原因

研究证实[11]，在肿瘤的发生发展过程中DNA高甲基化比低甲基化更为常见。DNA 高甲基化是癌变过程中早期的分子异常之一，也是早期发现肿瘤的潜在生物学标志，其对肿瘤患者的早期检测、治疗和预后等都有重要意义。导致肿瘤高甲基化模式改变可能和以下因素有关：（1）保护胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤岛（CpG岛）免受甲基化因子的丢失。在正常细胞中，多数基因启动子区通常处于非甲基化状态，这可能和一些保护性因子如反式作用因子等的存在有关。在E-cadherin基因启动子[12]甲基化的癌细胞株中，导入外源性非甲基化启动子，其E-cadherin的表达明显小于启动子非甲基化的癌细胞株，表明 E-cadherin的完全表达需要CpG岛保护因子。（2）肿瘤中DNMTs的过度表达。研究发现 DNMTs，尤其是 DNMT1在肿瘤组织中表达水平升高，这提示DNMTs与肿瘤中的甲基化异常有关， 并参与肿瘤的发生发展。（3）DNMT复合体调控障碍。DNMT调控障碍或靶向错误可能归咎于DNMT复合体一种或多种因子的缺乏，如pRB、DMNP1和 TSG101等。几乎所有恶性肿瘤的Rb通路（调控细胞周期）都受到破坏，所以有理由相信癌细胞CpG 岛甲基化与DNMT1/pRB相互作用障碍有关联[13]。

2.2.2 DNA高甲基化导致肿瘤发生的机制

在正常状态下基因启动子区的CpG岛一般是非甲基化的，当其发生高甲基化时，常导致抑癌基因、DNA修复基因等转录沉默，使之功能丧失从而导致正常细胞的生长分化调控失常以及 DNA 损伤不能被及时修复，这与多种肿瘤形成密切相关。

2.2.2.1 信号转导通路基因高甲基化

人类的runx3基因位于染色体1p36.1，是TGF-B信号转导通路下游的1个转录因子，在runx家族中runx3是最小的一个，含有的外显子数量最少，但却是哺乳动物的runx家族中最古老的1个。runx3 基因有2个启动子区域（P1和 P2），P2区域富含CpG二核苷酸。林东军等[14]研究表明runx3基因P2区域CpG岛在正常细胞中无甲基化，而在35%急性淋巴细胞白血病患者检测到甲基化水平显著升高，同时患者细胞中也均无该基因的表达，而正常细胞中均检测到runx3基因的表达，由此可见 runx3基因P2区域CpG岛甲基化导致了该基因表达缺失。由此我们推测，runx3基因表达缺失致使TGF-B信号转导通路受阻，从而影响了细胞的生长与分化，导致白血病的发生。

2.2.2.2 抑癌基因高甲基化

1989年人类肿瘤中抑癌基因CpG岛高甲基化首次在视网膜母细胞瘤（Rb）基因中发现。后来证明Rb基因启动子的高甲基化可以显著下调体外基因的表达。1994年发现VHL基因的失活也与甲基化相关，确定了肿瘤中启动子CpG岛高甲基化是基因失活的一个重要作用机制。Esteller等[15]研究了12种基因启动子甲基化的变化，包括p16（INK4a），p15（INK4b），p14（ARF），p73，BRCA1，hMLH1， GSTP1，MGMT，CDH1，TIMP3，DAPK，发现各抑癌基因启动子甲基化与其基因失活有关。

2.2.2.3 DNA修复基因的高甲基化

在肿瘤中，可以发现参与DNA修复的基因常由于启动子区高甲基化而失活。如：DNA修复基因O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6- MGMT）近来的研究证明存在于该基因启动子区或第一外显子内的CpG岛甲基化与其转录失活有关，而且这种变化可以使染色质进入关闭状态，进而导致核小体定位异常。该变化不仅存在于细胞系中，也发生在原位癌中，在肺癌、乳腺癌、大肠癌和淋巴瘤细胞系中O6-MGMT启动子出现高甲基化。Matsukura等[16]研究发现MGMT基因沉默，如启动子甲基化可能是引起肝癌的一个重要机制。

3 DNA甲基化和肿瘤基因启动子区异常甲基化的相关研究

3.1 EGFR启动子异常甲基化相关研究

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是HER/ERB-B跨膜受体激酶家族成员之一。EGFR的过表达促进细胞的增殖、存活和迁移，与许多实体瘤病人的低存活率相关[17]。EGFR基因5'调控区包括1个富含GC的启动子，缺保守序列TATA盒和CAAT盒，有多个位点可以起始转录。EGFR启动子上多个位点存在多态性并与其活性升高相关[18]。已经发现在其基因上下游-1300～+600片段共包含178个CpG位点，EGFR转录失活及蛋白表达与活性和CpG位点甲基化状态有关。针对EGFR在肿瘤中的高表达，临床上出现了很多靶向药物。许多研究报道基因组DNA异常甲基化能下调相关基因表达并使其沉默，Scartozzi等[19]分析了52例结直肠癌患者的EGFR基因甲基化水平与EGFR单克隆抗体治疗敏感性的关系，结果显示，EGFR基因甲基化患者的疾病控制率和客观缓解率均显著低于EGFR基因未甲基化患者。孙俊杰等[20]研究了六种非小细胞肺癌细胞株对吉非替尼敏感性，发现EGFR基因启动子未甲基化的HCC827细胞对吉非替尼敏感，其EGFR基因高表达；EGFR基因启动子部分甲基化的H358细胞对吉非替尼相对敏感，其EGFR基因中等表达；EGFR基因启动子均为高甲基化状态的H1650、H1975、H1299、A549四种细胞，对吉非替尼不敏感，其EGFR基因低表达。推测EGFR基因启动子区高甲基化状态可能下调EGFR基因表达水平，从而影响NSCLC细胞对吉非替尼的敏感性。

3.2 氨甲蝶呤耐药细胞的甲基化相关研究

氨甲蝶呤（methotrexate，MTX）通过细胞膜上的还原叶酸盐载体（RFC）的主动转运机制进入细胞内，在叶酸聚谷氨酸合成酶（FPGS）的作用下谷氨酸化，MTX分子的谷氨酸残基再逐个连接上谷氨酸（达到2～6个），形成MTX聚谷氨酸盐（methotrexate polyglutamate，MTXPG）。MTX及MTXPG通过竞争性地抑制二氢叶酸还原酶（DHFR）活力，并且在细胞内停留更长时间。MTX广泛应用于急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、绒毛膜上皮癌、乳腺癌、头颈部癌、膀胱癌和肺癌等疾病的治疗，但是接受MTX治疗后肿瘤细胞容易引起变异，引起转移复发，导致治疗失败。Winter-Vann报道[21]MTX治疗肿瘤可能通过降低Ras基因羧基甲基化水平， 靶向抑制Ras信号传导杀伤肿瘤细胞；Kishi报道[22]MTX治疗的急性淋巴细胞白血病儿童细胞内DNA甲基化水平降低。研究发现以非小细胞肺癌A549细胞为研究对象，通过浓度递增结合低剂量持续诱导的方法诱导非小细胞肺癌A549细胞发生MTX获得性耐药，采用高效毛细管法检测细胞内的整体DNA甲基化水平发现细胞内DNA甲基化水平降低，且随着MTX耐药浓度增加，耐药细胞株甲基化程度依次降低，推测这可能与细胞内叶酸水平降低有关。

3.3 白血病相关基因启动子区异常甲基化的研究

近年来研究发现DNA甲基化也是白血病表观遗传学改变中较常见的改变。在白血病的发展中，甲基化对基因表达的调控和基因结构的稳定起着重要的作用，高甲基化可能导致白血病的发病，而且这种表观遗传缺陷会对B和T-ALL的预后产生影响[23]。启动子区甲基化异常的CDKN2B基因也成为急性早幼粒白血病不良预后的一个因素[24]。P15基因和P16基因[25]的甲基化与白血病的关系目前研究比较深入。在髓系[26]、淋系[27]及双表型白血病均发现有p15和pl6启动子甲基化。Garcia-Manero等[28]研究了80例成人淋巴细胞白血病，检测了MDR1，THBS2，MYF3，ER，p15，THBS1，CD10，C-ABL几种基因，发现82%的病人至少有一个基因是甲基化的，42.5%的病人有三个或者更多的基因是甲基化的。

4 DNA甲基化和去甲基化治疗的展望

随着研究的不断深入，CpG 岛甲基化对肿瘤抑制基因失活的关键作用凸现出来，成为当今肿瘤学研究的新热点。如果说胚胎发育时期 DNA甲基化的调控能有效阻止有害基因的表达，那么肿瘤抑制基因CpG岛非甲基化状态就能保护体细胞避免发生恶性转化。启动子异常甲基化在细胞癌变过程中是个早期、频发事件，可以作为肿瘤发生的敏感生物学标志物。一些临床实验也表明，去甲基化药物可以使肿瘤基因启动子区异常甲基化程度进行性减低，并可使失活基因重新表达，抑制白血病细胞的生长，这将为肿瘤基因治疗提供了一条新途径。前已述及DNA甲基化的肿瘤异化状态是远较DNA顺序改变类的遗传性损伤容易纠正的缺陷，因此，将肿瘤中这类基因DNA甲基化异化谱式特异性地纠正过来，逆转启动子区域甲基化，继而改变其表达状态，已被认为是极有潜力的肿瘤基因治疗的新手段。去甲基化药物的发展也为临床治疗提供了有光明前景的治疗思路，去甲基化治疗作为一种新的治疗途径可能对防止恶性血液病化疗及复发也有一定作用。其中5-杂氮-2'-脱氧胞苷（CdR）去甲基化功能应用于临床肿瘤治疗，有研究显示在治疗急性白血病和慢性髓性白血病危象时有明显疗效。国外采用CdR联合化疗药物安吖啶或去甲氧基柔红霉素治疗难治复发的急性淋巴细胞白血病也有显著效果。虽然去甲基化治疗在肿瘤和白血病的治疗中取得了一定成效，但仍需对其作用机制及用药的安全有效性进行更深入的研究。

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Aberrant methylation of tumor gene promoter and tumorigenesis

SUO Meifang1, SHEN Zuojun2★
(1.Department of Medicine Laboratory of Bengbu Medical College, Anhui, Bengbu 233030, China; 2.Af fi liated Provincial Hospital of Anhui Medical University, Anhui Provincial Center for Clinical Laboratories, Anhui, Hefei 230001, China)

Tumorigenesis and development is a complex process which relates to multi-gene, multistep carcinogenic factors, includeing the proto-oncogene and tumor suppressor gene alterations, mutations in mismatch repair genes, DNA methylation and microsatellite instability. Oncogene hypomethylation and hypermethylation of tumor suppressor genes play an important role in tumor development, the regulation of gene expression, gene structure stability. DNA methylation is a process of methyl, which S-adenosyl methionine (SAM) as a methyl donor, transferred to the speci fi c base under the catalysis of DNA methyltransferase. Methylation abnormality is considered to be one of the characteristics of the tumor and an important epigenetic modi fi cation in the genome, which associates with many of the malignant transformation of cells, tumor invasion and metastasis. The change of local gene methylation patterns has become a remarkable research fi eld. This paper reviews the progress of DNA methylation and tumor gene promoter methylation.

DNA methylation; DNA methyltransferase; Epidermal growth factor receptor; Promotor

1.蚌埠医学院医学检验系，安徽省，蚌埠 233030

2.安徽医科大学附属省立医院，安徽省临床检验中心，安徽，合肥 230001

★通讯作者：沈佐君：E-mail:shenzuojun@163.com