复合乳酸菌对肠出血性大肠杆菌O157∶H7抑制作用的研究

王 菲，张继伦，宁喜斌，*

(1.上海海洋大学食品学院，上海201306;2.上海出入境检验检疫局，上海201202)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是指能从发酵性碳水化合物(主要是葡萄糖)产生乳酸的革兰氏阳性细菌的总称。国内外诸多专家研究表明大部分乳酸菌对人体具有特殊的生理调节和营养功能，能够维护肠道消化系统健康，调节机体胃肠道正常菌群，增强免疫力，降低血清胆固醇，延缓机体衰老，抗肿瘤，预防癌症等作用［1－3］。乳酸菌已广泛应用于乳制品、肉制品以及蔬菜的发酵与防腐中。许多乳酸菌除产生乳酸、乙酸、丙酸外，还能产生具有抑菌或杀菌的生物活性物质，所以利用乳酸菌抑制有害微生物对保障我国人民的身体健康，改善我国食品生产企业的产品结构以及提高其经济效益具有很大的促进作用［4－5］。虽然国内外很多研究已经证实了某些乳酸菌对大肠埃希菌 O157∶H7的抑制作用［6］，但是它们大多集中在乳酸菌抑菌特性的研究，而对于研究具体哪几种乳酸菌复合以及复合后这几种乳酸菌如何配比具有最佳抑制大肠杆菌O157∶H7的效果却很少涉及。因此，本文将实验室保存的几株常见乳酸菌以不同形式组合后抑制大肠杆菌O157∶H7，选取实验得出的具有最佳抑菌效果的乳酸菌组合，将组合中几株乳酸菌以不同比例配比后进行抑制大肠杆菌O157∶H7，从而获得抑制大肠杆菌 O157∶H7生长的高效复合益生菌，为今后制备益生菌制剂提供实际依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

表1 4株乳酸菌的11种不同组合形式Table 1 The 11 different composes of four lactobacillus

大肠杆菌(E scherichia coli O157∶H7)、乳酸菌:SL1(嗜酸乳杆菌，Lactobacillus acidophilus)、SL2(鼠李糖乳杆菌，Lactobacillus rhamnosus)、SL3(干酪乳杆菌，Lactobacillus casei)、SL4(植物乳杆菌，Lactobacillus plantarum)、SL5(副 干 酪 乳 杆 菌，Lactobacillus paracasei)、SL6(嗜 热 链 球 菌，Streptococcus thermophilus)、SL7(短乳杆菌，Lactobacillus brevis)均为实验室分离保存。

MRS培养基、营养肉汤培养基、伊红美兰培养基、YPD培养基、PBS缓冲液等均购于上海疾控中心。

Class II BSC生物安全柜 新加坡ESCO公司;台式pH精密测试仪 德国WTW;隔水式恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;不锈钢自动手提式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;DGG－9003型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 乳酸菌与E.coli O157∶H7混合培养

1.2.1.1 单一乳酸菌与E.coli O157∶H7混合培养 将实验室保存的7株常见乳酸菌分别按5%的比例接种于YPD液体培养基中培养后计数，然后分别稀释至107cfu/mL，各取菌液100μL接种到5mL MRS液体培养基中培养12h。再将E.coli O157∶H7培养并稀释至107cfu/mL后转接100μL至含有乳酸菌的MRS液体培养基中，在相同条件下以E.coli O157∶H7单独培养作为空白对照。

1.2.1.2 复合乳酸菌与E.coli O157∶H7混合培养 通过上述实验得到的几株对E.coli O157∶H7有明显抑制效果的乳酸菌。将这几株乳酸菌以相同比例混合后活化稀释至细菌总数为107cfu/mL，以下方法同1.2.1.1。

1.2.1.3 E.coli O157∶H7菌落数的测定 将1.2.1.1和1.2.1.2中单一及复合乳酸菌与E.coli O157∶H7混合培养的菌液，于培养24、48、72、96 h时分别取样涂布于伊红美兰琼脂平板，将平板置于恒温箱内，37℃培养24h后计数E.coli O157∶H7菌落数。

1.2.2 乳酸菌菌液、发酵滤液和菌体悬液抑菌实验

1.2.2.1 乳酸菌菌液抑菌实验 将上述实验得到的对大肠杆菌有抑制作用的几株乳酸菌分别接种于MRS液体培养基中，另外将这几株乳酸菌以相同比例混合后同样接种于MRS液体培养基中，培养24、48、72、96 h。将活化稀释好的 E.coli O157∶H7 吸取200μL在营养琼脂平板涂布，制成大肠杆菌板，无菌条件下将牛津杯放在平板上然后分别在4个培养时间阶段下从单一乳酸菌和复合乳酸菌液中吸取200μL加入牛津杯中，每个菌株做3个平行，将平板平放至恒温培养箱中，37℃培养24 h，测其抑菌圈直径。

1.2.2.2 乳酸菌发酵滤液抑菌实验 同1.2.2.1的方法，分别在培养24、48、72、96h时取培养液3000×g离心10 min后，除菌体取上清液，经小滤器过滤(滤膜孔径0.22μm)，收集滤液即为发酵滤液。采用牛津杯法进行抑菌实验，以下方法同1.2.2.1。同时测定各检测时间段发酵滤液的pH。

1.2.2.3 乳酸菌菌体抑菌实验 将上述离心后的菌体沉淀用PBS缓冲液(pH7.0)洗涤3次，再用生理盐水稀释成原菌液浓度后采用牛津杯法进行抑菌实验，方法同1.2.2.1。

1.2.3 不同组合的复合乳酸菌抑菌实验 将实验得到的对E.coli O157∶H7有抑制效果的几株乳酸菌进行排列组合(C(n，m))得到11种不同形式的组合(见表1)，组合中各个菌株以1∶1的比例进行混合，每株菌分别取100μL菌液于MRS液体培养基中进行混合培养24、48、72h。采用牛津杯法进行抑菌实验，每种组合做3个平行，将平板平放至恒温培养箱中，37℃培养24 h，测其抑菌圈直径。

1.2.4 复合乳酸菌不同配比的抑菌实验 从上述实验中获取具有最佳抑菌效果的乳酸菌组合，以这个组合中几株乳酸菌为因素，采用正交实验中三因素三水平实验设计方案得到9种不同形式配比的复合乳酸菌(设计方案见表2)，分别于培养24、48、72h时采用牛津杯法进行抑制E.coli O157∶H7实验，每个组合做3个平行，将平板平放至恒温培养箱中，37℃培养24 h，测其抑菌圈直径。

表2 3株乳酸菌的正交实验设计方案Table 2 The orthogonal desigh of three lactobacillus

2 结果与分析

2.1 乳酸菌与E.coli O157∶H7混合培养

抑菌结果如表3所示，7株乳酸菌分别与E.coli O157∶H7在MRS液体培养基中混合培养，其中有4株乳酸菌对E.coli O157∶H7产生明显抑制作用，分别是 SL1、SL2、SL3、SL4。E.coli O157∶H7 在与 SL1、SL2、SL3、SL4分别培养达到96h时，培养液中E.coli O157∶H7数量基本为0。其中SL3对E.coli O157∶H7的抑制效果最好，优于另外3株乳酸菌，差异显著(p＜0.05)。SL2在各检测时间点的抑菌能力仅次于SL3。再将这4株乳酸菌混合后与E.coli O157∶H7共同培养，结果显示混合后的乳酸菌在与E.coli O157∶H7培养时间达到72h时，培养液中E.coli O157∶H7的数量已经为0，说明将这4株乳酸菌混合后对E.coli O157∶H7的抑制效果明显提高，强于任意单独乳酸菌的抑菌效果，差异显著(p＜0.05)。

表3 不同培养时间的E.coli O157∶H7数量(lg cfu/mL)Table 3 The number of E.coli O157∶H7 at different time(lg cfu/mL)

2.2 乳酸菌菌液、发酵滤液和菌体对大肠杆菌的抑制实验

将SL1、SL2、SL3、SL4 单独及复合后的菌液、发酵滤液和菌体悬液，分别用牛津杯法做抑菌实验，结果表明菌液和发酵滤液均可抑菌，经测量，其抑菌圈大小几乎一致，说明乳酸菌菌液与发酵滤液的抑菌能力无差异，而菌体悬液在各个检测时间段都不具备抑菌能力，没有抑菌圈。说明其产生的抑菌物质主要存在于代谢产物中。4株菌单独、混合培养不同时间段的发酵滤液pH见表4，随着培养时间的增加各菌滤液的pH有所下降，SL2在各个培养时间段，测得滤液的pH较另外3株单独乳酸菌发酵滤液的pH低，说明了4株乳酸菌中SL2的产酸能力最强。而将4株乳酸菌混合培养后各培养时间段所测得发酵滤液的pH下降最快，且明显低于任意单独乳酸菌的pH，说明4株乳酸菌混合培养后，其产酸能力也有了明显提高。

2.3 不同组合的复合乳酸菌对E.coli O157∶H7生长的抑制作用

将上述实验得到的对E.coli O157∶H7有明显抑制作用的4株乳酸菌(SL1、SL2、SL3、SL4)通过排列组合(C(4，2)+C(4，3)+C(4，4)=11)得出 11 种不同混合形式的组合，通过牛津杯法抑菌实验后测量抑菌圈直径大小(结果见表5)。实验结果表明其中第10组和第11组抑菌效果最好，明显优于其他9组，差异显著(p＜0.05)，而第11组在各检测时间点的抑菌效果都强于第10组，差异不显著。分析认为第11组由 SL2、SL3、SL4组合成的复合乳酸菌对E.coli O157∶H7的抑制效果最好。

表4 不同培养时间乳酸菌发酵滤液的pHTable 4 pH values of fermented filtrations of four lactobacillus cultured for different time duration

表5 4株乳酸菌不同组合对E.coli O157∶H7的抑菌圈大小(lgcfu/mL)Table 5 Zone of inhibition of the different composes of four lactobacillus on E.coli O157∶H7(lgcfu/mL)

2.4 不同的复合乳酸菌配比对E.coli O157∶H7生长的抑制作用

将上述实验得到的具有最佳抑菌效果的乳酸菌组合(SL2、SL3、SL4)采用三因素三水平设计法，研究不同配比对E.coli O157∶H7的抑制效果。由表6可知，第1组，第4组，第7组抑菌效果比较好，相比其余6组差异显著(p＜0.05)，其中第7组在各检测时间点抑菌效果最强。分析认为，以第7处理组(SL2、SL3、SL4 的比例为 3∶1∶3)对 E.coli O157∶H7 的抑制效果最好。

表6 3株乳酸菌不同配比对E.coli O157∶H7的抑制圈大小(lg cfu/mL)Table 6 Zone of inhibition of the different proportions from three lactobacillus on E.coli O157∶H7(lgcfu/mL)

3 结论与讨论

本次实验通过单一乳酸菌与E.coli O157∶H7混合培养后对E.coli O157∶H7计数得到4株对E.coli O157∶H7 有明显抑制作用的乳酸菌(SL1、SL2、SL3、SL4)。再将这4株乳酸菌混合后对E.coli O157∶H7进行抑制实验，结果显示，4株乳酸菌混合后对E.coli O157∶H7的抑制效果强于任意单独乳酸菌抑菌效果，差异达显著水平(p＜0.05)。

将SL1、SL2、SL3、SL4 单独和混合后的菌液、发酵滤液、菌体悬液通过牛津杯法进行抑制大肠杆菌的实验，结果表明，乳酸菌的菌液和发酵滤液的抑菌能力无差异，而菌体悬液经检测没有出现抑菌圈，说明乳酸菌抑菌的有效成分在代谢产物中。测得4株菌单独、混合培养发酵滤液的pH，其中SL2在各培养时间段的pH低于另外3株单独培养的乳酸菌发酵滤液，说明SL2产酸能力较强。而将这4株乳酸菌混合培养后，其各检测时间段的发酵滤液pH下降最快，且各时间段的pH明显低于4株单独乳酸菌，说明这4株乳酸菌混合后的产酸能力也明显增强。

以排列组合方式(C(n，m))将 SL1、SL2、SL3、SL4分为11种不同混合形式后对E.coli O157∶H7进行抑制实验，结果显示(SL2、SL3、SL4)3株乳酸菌混合后对E.coli O157∶H7具有最佳抑制效果，再将这3株乳酸菌采用正交设计方案以不同比例混合培养后进行抑制 E.coli O157∶H7实验，结果显示:SL2、SL3、SL4混合配比在3∶1∶3时发挥的抑菌效果最佳。

实验中SL2、SL3、SL4 3株乳酸菌混合后对E.coli O157∶H7具有最佳抑制效果，说明这3株乳酸菌混合培养后具有协同作用，且代谢产物中产生更多具有抑菌活性的物质［7］。随着培养时间的增加，乳酸菌的抑菌能力也相应提高，说明了乳酸菌在不断繁殖时所产生的抑菌物质在增加［8－9］。3株乳酸菌发挥最佳抑制作用的时间基本在48～72h。这可能与菌种的生长速度、代谢活跃的程度存在一定关系。那么，在应用其进行抑菌时应注意控制添加的时间，以保证其发挥作用的有效性［10－11］。本实验研究结果表明，乳酸菌组合(SL2、SL3、SL4)以 3∶1∶3 比例来制备复合菌剂时，对E.coli O157∶H7的抑制效果最好。这个较为理想的益生菌最佳组合，可有效预防和抑制食品中有害微生物同时还可以一定程度上发挥对人体有益的生理功能，为实际生产推广应用提供了理论依据。

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