白花蛇舌草提取物体外抑制K562细胞增殖实验研究

陈筱凡 杭州市中医院检验科 杭州 310006

白花蛇舌草提取物体外抑制K562细胞增殖实验研究

陈筱凡 杭州市中医院检验科 杭州 310006

目的：观察白花蛇舌草提取物（HDE）体外对人白血病细胞株K562增殖的影响，探讨HDE用于治疗白血病的作用机制。方法：以白血病K562细胞株为靶细胞，观察不同浓度的HDE对K562细胞增殖的影响，及胞内线粒体跨膜电位（ΔΨm）的水平；检测低浓度HDE处理前后胞内Survivin、Bcl-2基因表达。结果：HDE（6.4mL/L）能明显抑制K562细胞增殖，且与浓度呈正相关（P＜0.05或P＜0.01）。通过流式细胞术对碳氰化合物类亲脂性荧光染料（JC-1）检测发现，HDE能使靶细胞内ΔΨm降低，且与HDE处理浓度呈负相关；K562细胞经低浓度HDE（3.2mL/L）处理3周后，Survivin、Bcl-2基因表达均低于未经处理细胞的2.7倍和1.6倍。结论：HDE可能通过降低线粒体跨膜电位，抑制抗凋亡基因的表达，抑制K562白血病细胞增殖。

白花蛇舌草提取物 K562细胞 跨膜电位 凋亡基因

白花蛇舌草是我国民间治癌的有效中草药，具有活血化瘀、清热解毒、消肿止痛等功效，临床上用于湿热蕴毒所致上呼吸道感染、阑尾炎、肺炎、扁桃体炎及术后感染[1]。近年研究显示白花蛇舌草提取物（HDE）对白血病也有较好的疗效[2-3]。笔者以K562细胞作为靶细胞，观察HDE对白血病细胞线粒体跨膜电位等的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 白花蛇舌草提取物购于通化振国药业有限公司，批号091015。处理细胞时，用RP⁃MI1640（Gibco）配置成所需浓度的工作液（终浓度分别为：1.6mL/L、3.2mL/L、6.4mL/L、12.8mL/L和25.6mL/ L）。K562细胞株购于中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所。用含10%小牛血清的RP⁃MI1640培养液培养，每2～3天传代1次，然后取对数生长期细胞进行后续实验。

1.2 方 法

1.2.1 HDE对K562细胞增殖抑制试验 用含10%小牛血清、1×105细胞/mL和不同浓度的HDE的培养体系共200μL，置于96孔板中，每个浓度作4个平行孔，以不加HDE作对照组。培养72h，在终止培养前4h加MTT（5g/L）20μL/孔，离心，每孔加150μL DMSO，振荡，酶标仪570nm处测吸光度（A570）。

1.2.2 线粒体跨膜电位（ΔΨm）水平检测 不同浓度的HDE分别处理K562细胞24、48、72h后，PBS洗涤2次，调整细胞浓度（1×106/mL），加入碳氰化合物类亲脂性荧光染料（JC-1）5μL（1mg/mL），混匀，置于37℃、5%CO2的培养箱中，避光孵育30min，再PBS洗涤2次后进行流式细胞仪检测，荧光通道FL1（520nm，绿色）和FL2（590nm，红色）与荧光强度，计算FL1与FL2的比值，表示线粒体跨膜电位水平变化。

1.2.3 HDE处理前后Survivin、Bcl-2基因表达 ①总RNA提取：收集足够的细胞按照Trizol一步法操作。分装-80℃保存，备用。②半定量RT-PCR两基因扩增：cDNA合成：20μL逆转录体系含有5×Bfr、Oligo dT、dNTP、RNasin、M-MLV逆转录酶。PCR扩增：体系包括10×PCR反应缓冲液、MgCl2、10mM dNTP、Survivin或Bcl-2引物、β-actin、Taqase、RT产物、DEPC水。94℃变性55Sec，55℃退火1min，72℃延伸1min，33个循环；最后72℃延伸10min。③产物电泳：取产物10μL，琼脂糖凝胶（1.2%），电泳3h，进行观察、拍照并用凝胶图像分析系统分析，保存。实验重复3次。见表1。

表1 PCR扩增各引物序列

2 结 果

2.1 HDE抑制K562细胞增殖作用 MTT结果显示，1.6mL/L、3.2mL/L浓度的HDE对K562细胞几乎无抑制作用，与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），中浓度以上HDE（6.4mL/L）可抑制K562细胞增殖，并与浓度相关，见表2。

2.2 HDE处理前后线粒体跨膜电位（ΔΨm）水平变化 HDE处理24h后，细胞线粒体跨膜电位有所下降。48h后细胞内线粒体跨膜电位下降的百分率显著增加，FL1/FL2比值明显增大。细胞继续培养至72h后，胞内线粒体跨膜电位下降无明显变化，见图1～2。

2.3 HDE处理前后Survivin、Bcl-2抗凋亡基因表达结果 半定量RT-PCR检测结果显示HDE（3.2mL/ L）处理2周前后，Survivin、Bcl-2表达变化不明显；处理至3周左右时，Survivin、Bcl-2表达都明显低于未经处理过细胞的2.7倍和1.6倍，见图3。

表2 不同浓度HDE对K562细胞增殖抑制作用（±s）

表2 不同浓度HDE对K562细胞增殖抑制作用（±s）

注：与HDE 0mL/L比较，*P＜0.05，**P＜0.01

HDE/（mL/L）0 1.6 3.2 6.4 12.8 25.6 n/孔444444吸光度0.94±0.05 0.90±0.06 0.88±0.07 0.75±0.06* 0.62±0.05** 0.35±0.04*

图1 不同浓度HDE作用对K562细胞跨膜电位的影响

3 讨 论

研究表明，各种死亡信号诱导线粒体膜通透性改变孔（PTP）开放，引起线粒体跨膜电位下降，使膜通透性增高，导致促凋亡物质释放，继而激活Caspase一系列酶，最终引起细胞凋亡[4]。线粒体内膜跨膜电位（△Ψm）是反映线粒体内膜通透性的最佳指标之一。它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，如果线粒体跨膜电位崩溃，那么细胞凋亡将不可逆转。当PTP开放时，＜1.5KD的分子通过，导致内膜两侧离子梯度消失，△Ψm崩溃，呼吸链与氧化磷酸化失偶联，ATP合成停止，Ca2+外流，还原性谷胱甘肽和NAD（P）H2减少，超氧阴离子增加，凋亡诱导因子（AIF）释放等，最终引起细胞凋亡或死亡[5]。研究证实细胞凋亡的早期阶段，在细胞核病理改变出现前，ΔΨm已经下降，提示ΔΨm下降为凋亡的早期阶段[6]。JC-1在正常细胞线粒体膜电位较高时，能聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，在激光共聚焦显微镜下可见桔黄色荧光；在凋亡早期细胞中因线粒体膜电位下降，JC-1不能聚集在线粒体的基质中,以单体在胞浆内积聚，在激光共聚焦显微镜下可见绿色荧光。

图2 不同浓度HDE处理K562细胞48h后流式细胞术检测结果（A：1.6mL/L、B：3.2mL/L、C：6.4mL/L、D：12.8mL/L、E：25.6mL/L）

图3 HDE处理K562细胞后Survivin和Bcl-2mRNA表达

Bcl-2家族蛋白可以调节PTP通道的开放及其细胞色素C、AIF的释放，还可以改变线粒体外膜的通透性。癌基因产物丝-苏氨酸激酶(c-Raf)蛋白与位于线粒体外膜的Bcl-2蛋白及构成PTP通道的核心电压依赖性阴离子孔道（VDAC）结合形成复合体，抑制VDAC诱导的线粒体膜去极化，干预功能性PTP通道的形成，阻断细胞色素 C自线粒体释放，抑制细胞凋亡[7]，而位于线粒体外膜的促凋亡因子Bax的转位，可导致△Ψm降低，细胞色素 C释放入胞质，促进细胞凋亡。因此影响Bcl-2家族（特别是Bcl-2、Bax）表达的因素，均能引起细胞的凋亡或死亡。

本研究结果显示，HDE能抑制K562白血病细胞恶性克隆增殖，HDE处理24h后就能引起K562细胞线粒体跨膜电位的下降，48h后线粒体跨膜电位下降最明显，其后下降无明显变化。低浓度HDE培养3周后能明显抑制Survivin、Bcl-2抗凋亡基因表达，故推测HDE能抑制白血病细胞增殖，其机制可能使线粒体跨膜电位下降，导致通透性增加，促凋亡蛋白被释放到细胞质中，这些促凋亡蛋白或激活caspase、或独立地破坏核内染色质,从而引起细胞凋亡。

［1］Zhong LM，Zhou HX，Liu D.Recent development of studies on clinical application and phamacological functions of old⁃enlandia difusa wild［J］.Inf Tradit Chin Med（中医药信息），2001，l8（4）：14.

［2］黄景玉，王祥麒，高萍.白花蛇舌草针联合化疗治疗急性非淋巴细胞白血病临床观察［J］.河南中医药学刊，2001，16（4）：38.

［3］Jiangsu New Medical College.Herbal macro-dictionary（中药大辞典）［M］.Shanghai：Shanghai People Publishing Company，1997：754.

［4］蔡循，陈国强，陈竺，等.线粒体跨膜电位与细胞凋亡［J］.生物化学与生物物理进展，2001，28（1）：3.

［5］Fall CP，Bennett JP.Visualization of cyclosporin A and Ca2+ sensitive cyclical mitochondrial depolarizations in cell culture［J］.Biochim Biophy Acta，1999，1410（1）:77.

［6］Zamzami N，Marchetti P，Castedo M，etal.Reduction in mitochondrial potential constitutes an early irreversible step of programmed lymphocyte death in vivo［J］.J Exp Med，1995， 181（5）:1661.

［7］Le Mellay V，Troppman J，Benz R，et al.Negative regulation of mitochondrial VDAC channels by C-Raf kinase［J］.BMC Cell Biol，2002，3（1）:14.

Hedyotis Herb Extracts Inhibited the Proliferation of Human Leukemia Cell Line K562 in vitro

CHEN Xiaofan. Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou(310006)，China

Objective:To determine the effect of hedyotis herb extracts(HDE)on the proliferation of human leukemia cell line K562 in vitro.Methods:Human leukemia cell line K562 was used and was treated by varied concentrations of HDE(1.6,3.2,6.4,12.8,25.6ml/L).Variation of mitochondrial transmembrane potential was measured be⁃fore and after treatment.Survivin and Bcl-2 in K562 cells were detected before and after treatment of 3.2ml/L HDE for 3 weeks.Results:HDE at the dose of 6.4m l/L inhibited the proliferation of K562 cells and the effect was enhanced as the dose increased.HDE decreased mitochondrial transmembrane potential in K562 cells and the decrease was negatively related to the concentration of HDE.The expression of survivin and Bcl-2 on K562 cells before the treatment of 3.2m l/L HDE was 2.7 and 1.6 times higher than those after treatment.Conclusion: HDE can inhibit the proliferation of K562 cells by decreasing mitochondrial transmembrane potential and sup⁃pressing anti-apoptosis genes.

hedyotis herb extracts K562 cells transmembrane potential apoptosis genes

2012-08-31