肌上皮细胞在大鼠腮腺萎缩过程中的转归

2013-05-10赵腾达左金华王丽芳等

华西口腔医学杂志 2013年1期

关键词：腮腺

赵腾达　左金华　王丽芳等

[摘要] 目的研究大鼠腮腺主导管结扎后萎缩腮腺内肌上皮细胞（MEC）的转归规律。方法通过结扎大鼠右侧腮腺主导管诱导腺体萎缩，采用苏木精-伊红（HE）染色观察正常腮腺及导管结扎后1、3、5、7、14、21、30、60、100、150 d萎缩性腮腺的组织学变化，并采用免疫组织化学染色方法定量分析MEC在腮腺萎缩不同时间点的数量及分布情况。结果组织学观察发现：腮腺主导管结扎5 d后，大部分腺泡细胞出现凋亡丧失，在腺体萎缩过程中形成大量导管样结构，间质逐渐纤维化并伴有炎性细胞浸润。免疫组织化学染色定量分析结果显示：导管结扎后5 d内，MEC数量快速增加，随后其数量增长缓慢，维持在一定的范围内，100 d时MEC数量达到峰值，其后快速减少；在腮腺萎缩早期，MEC位于腺泡及闰管表面，呈星形或梭形，随着腺体的萎缩，最终呈梭形分布于导管样结构的外层。结论在导管结扎后5 d内，MEC出现反应性大量增殖，随后数量增长缓慢，维持在一定的范围内；随着腮腺的逐渐萎缩，100 d后MEC数量快速减少。

[关键词] 肌上皮细胞；腮腺；萎缩；导管结扎

[中图分类号] R 780.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.007 由于受到头颈部肿瘤放射治疗、舍格伦综合征及唾液腺炎等因素的影响，人体大唾液腺会出现腺体萎缩和唾液分泌功能下降等现象，给患者的生理、心理带来严重的影响，但目前尚无有效的治疗手段。如何治疗唾液腺萎缩和促进腺体功能恢复已经日益引起人们的重视。在唾液腺组织成分中，肌上皮细胞（myoepithelial cell，MEC）被普遍认为是可能导致唾液腺肿瘤（包括多形性腺瘤、肌上皮瘤等）发生的潜能祖细胞之一[1]，其内含肌动蛋白，能够接受交感

及副交感神经α1-肾上腺素受体及毒蕈碱受体的协同诱导作用而发生收缩，促进腺泡及导管的分泌[2]，抑

制唾液腺的萎缩。目前对长期萎缩性腮腺内MEC病理变化的研究仍然较少。本实验通过结扎大鼠腮腺主导管[1，3]诱导腺体发生渐进性萎缩，并应用免疫组织化学方法定量测定MEC在萎缩性腮腺不同时间点的数量及分布，结合腺体的组织学变化，观察MEC在腮腺萎缩过程中的转归规律。

1 材料和方法

1.1 实验对象

成年健康的雄性SD大鼠66只，体重（300±20） g，购于山东绿叶制药有限公司。66只大鼠随机分为11组，每组6只，常规饲养。

1.2 实验方法

用质量分数3%水合氯醛行腹腔内注射麻醉，剂量为10 mL·kg-1。麻醉后将大鼠右侧腮腺嚼肌区备皮后置于无菌操作台上，消毒，于右耳前下方作长约1 cm的纵形小切口，暴露眶外泪腺；在眶外泪腺下极的中部分离出咬肌表面的腮腺主导管及伴行神经，用3—0丝线结扎腮腺主导管，缝合皮肤。术后常规饲养，分别将各组大鼠于导管结扎后第0（正常对照

组）、1、3、5、7、14、21、30、60、100、150天处死，切取右侧腮腺，放入质量分数4%的多聚甲醛固定液中固定。

1.3 组织学观察

各组动物的腮腺组织样本固定24 h后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，然后浸蜡、包埋，制成4 μm厚切片，行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，置于光镜下观察腮腺的组织学变化。

1.4 免疫组织化学观察

采用特异性α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）对腮腺标本进行免疫组织化学染色，染色采

用SABC法，抗体稀释度为1∶250，DAB显色，苏木精轻度复染，观察MEC的表达情况。

1.5 MEC计数及统计分析

将免疫组织化学切片放置于Olympus BX51型（Olympus公司，日本）显微镜的高倍镜下观察。每张切片随机选择5个视野拍照，采用ImagePro Plus 6.0图像软件计数MEC的数目。实验数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析，各组均数的比较采用单因素方差分析，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 大体观察结果

导管结扎1 d时，大鼠右侧腮腺的体积较正常对照组明显增大，腺小叶水肿、分界不清；3 d时，腺体体积恢复正常；7 d时，腺体体积明显减小。随着导管结扎时间的延长，腺体组织逐渐缩小，色泽加深呈灰色，质地变韧；小叶间隔增厚，并可分离缩小的腺小叶。结扎100 d时，腺体缩小明显，体积约为正常腺体的一半；150 d时，腺体组织内完全看不到腺小叶结构。

2.2 组织学观察结果

正常对照组：腮腺组织正常；覆盖在腺体表面的纤维结缔组织被膜深入腺实质，将腺体分成许多腺叶和腺小叶，腺实质内见有浆液性腺泡及导管系统（闰管、纹管及排泄管），腺泡细胞大小均匀，排列规则（图1A）。结扎1 d组，腮腺内除可见部分导管扩张以外，腺实质与正常对照组基本相似。3 d组，腺小叶的排列开始出现紊乱现象，腺泡细胞未见消失。5、7 d组，腮腺的腺体组织出现较明显的变化：大部分腺泡细胞消失，残余腺泡局限于腺小叶周边，导管样结构明显；小叶间隔增厚，内有单核细胞浸润（图1B）。14 d组，腺体内腺泡萎缩严重，导管样

结构数目明显增加，单核细胞（主要为巨噬细胞）浸润在残余导管样结构内，小叶间隔纤维化并有大量淋巴细胞浸润。21 d组，导管样结构几乎组成了整个腺实质，在腺实质结构内存在淋巴细胞浸润。30 d组，腮腺内基本只包括扩张的导管样结构，由纤维结缔组织包绕，小叶间隔呈致密纤维化，并包含部分淋巴细胞及少数排泄管。60 d组，腺体内导管样结构的数目减少，出现不规则扩张（图1C）。100 d组，

导管样结构异形更加明显，管腔继续呈圆形扩张。150 d组，导管样结构及异形导管数量减少，腺实质广泛纤维化并逐渐代替腺体组织，已无明显淋巴细胞浸润（图1D）。

2.3 免疫组织化学染色结果

经免疫组织化学染色观察MEC的分布及形态变化见图2、3。在正常对照组及1 d组，腺泡及闰管边缘可观察到少量阳性表达的MEC（图2A）；3 d组的

MEC在腺泡表面呈星形，而在闰管处则呈梭形（图

3A）；5 d及7 d组可观察到MEC数目明显增加，其形态变化由梭形至星形不等，主要位于导管样结构周围（图2B）。随着腺体的萎缩，腺泡细胞的完全丧失及大量导管样结构的出现，21、30 d组可观察到腺实质内的大导管几乎全部被梭形的MEC所包绕，导管样结构呈典型的双套层结构，大量阳性表达的MEC主要位于外层；60、100 d组导管样结构的管腔继续呈圆形扩张，数量减少，MEC阳性表达的表现类似于30 d组（图2C）；150 d组的导管样结构管腔变小，

MEC呈梭形包绕在导管样结构的外层（图3B），MEC数量较前几组明显减少（图2D）。

A：腮腺萎缩早期（3 d组），MEC在腺泡表面呈星形（空箭头），在闰管处呈梭形（黑箭头）；B：腮腺萎缩晚期（150 d组），MEC呈梭形（黑箭头），包绕在导管样结构的外层。

Fig 3 Morphology of MEC during the early and late phase of

glandular atrophy oil immersion lens × 1 000

2.4 MEC计数结果

腮腺导管结扎后不同时间点的MEC计数结果见表1。由表1可见：导管结扎后MEC数量显著增加，尤以5 d组增加最快，100 d达到最大值之后数量又迅速减少。经单因素方差分析，各时间点的MEC数符合正态分布及方差齐性（P=0.069），采用LSD法进行多重比较，结果发现：正常对照组MEC数除与1、150 d组无明显差异外，与其他各组的差异均有统计学意义（P<0.05）；3 d组与150 d组的差异无统计学意义

（P>0.05），与其他各组的差异均有统计学意义（P<

0.05）；自结扎第5天起，5 d组与随后的7、14、21、30、60 d组的差异均无统计学意义（P>0.05）；而100 d

组除与14、21、30、60 d组的差异无统计学意义外（P>0.05），与其他各组的差异均有统计学意义（P<

0.05）。

3 讨论

腺体萎缩是唾液腺疾病中最常见的病理变化，其萎缩过程较复杂。早期唾液腺萎缩可引起分泌功能减退，导致唾液流量减少。这一现象有学者[4]认为是

由炎症反应引起的，但Correia等[5]则认为非炎性机制（如腺泡萎缩）可能是主要原因。目前关于导管结扎后快速诱导腺体萎缩的具体机制仍不清楚。Takahashi

等[6]发现：Fas/FasL通过激活Caspase-8和Caspase-3，可以在诱导唾液腺细胞凋亡中发挥重要作用。通过结扎腮腺主导管诱导腺体萎缩，可观察到如下典型变化：腺泡细胞的凋亡丧失，大量导管样结构的出现，腺实质逐渐纤维化并炎性细胞的浸润，以及MEC的数量、位置及形态的改变。在萎缩过程中MEC在一定程度上能够抑制腺体的萎缩[3]。Walker等[7]发现：在正常唾液腺内很少观察到MEC，但随着腺体的渐进性萎缩，MEC阳性表达明显，并最终完全围绕在导管样结构周围；而Takahashi等[8]证实MEC在腺体

萎缩晚期的存活通过表达Bcl-2来维持。此外，MEC在继发性舍格伦综合征患者唾液腺炎症病变过程中亦可能作为靶细胞，被淋巴细胞浸润破坏后最终导致腺泡和导管上皮的丧失[9]。还有研究[10-11]发现：MEC的形态差异可能与唾液腺病理萎缩状态有一定的相关性，在萎缩唾液腺的腺泡表面包绕着典型的星状MEC可作为腺体功能恢复的早期征象。

本研究观察到，腮腺导管结扎1 d后，MEC平均数（641.00）较正常对照组（566.50）稍有增多，3 d组（945.50）明显增多，5 d组（1 430.25）的数量甚至达到正常对照组的2.5倍，这表明MEC在导管结扎后大量快速增殖，尤以导管结扎5 d时增加最多。导管结扎后5～30 d内，MEC数量虽有增加，但都维持在一定的范围内。该结果与Burgess等[1]观察到的MEC增殖

活性的结论相一致。腮腺导管结扎1周后，MEC环绕在部分残余导管表面，并发生形态变化，呈梭形至星形不等。笔者认为，MEC自身增殖以及对导管阻塞的抵抗效应是引起其数量增多的重要因素。

在腮腺萎缩过程中，腺泡细胞消失及导管样结构的出现导致腺体组织变化较大，因此MEC在腺体中的数量不仅与腺泡数量的多少有关，还与其本身的分布有关。本实验发现7 d组的MEC数量较5 d组略微减少，这可根据Burgess等[3]的观点进行解释：MEC

在萎缩过程中的变化主要与相邻的闰管有关，闰管在该期的增多导致单位视野内MEC相对减少，而腺泡细胞在该时间点的持续丧失亦可能是导致MEC数目减少的另一因素。至于腺泡表面的MEC是否随腺泡消失而自身发生凋亡，还是迁移到新增的导管样结构表面，仍需进一步研究。此外，60 d组MEC数量较30 d时减少，100 d达到峰值，150 d又迅速减少。通过观察腮腺的组织学变化可以发现：30 d时腺实质内存在大量小的圆形导管样结构；60 d时出现大的不规则的导管样结构，管腔扩张；100 d时可见导管样结构异形明显；150 d时异形导管及导管样结构数量减少，管腔变小；此外还发现邻近导管样结构有融合趋势。因此可以认为：30～150 d内的腮腺萎缩过程中，受间质结缔组织纤维化压力作用的影响，相邻多个小导管样结构发生融合形成大的不规则导管样结构，该改建过程引起MEC数量的暂时增加，融合完毕后受周围压力的继续影响，最终导致MEC数量减少，导管样结构异形减少，管腔变小并逐渐呈圆形。因此，在唾液腺萎缩晚期MEC所环绕的大导管的扩张，除考虑小导管融合外，亦与对腮腺的萎缩抑制效应有关。

总之，在腮腺导管结扎5 d后，MEC呈现反应性大量增殖，随后数量增长缓慢，维持在一定的范围内，随着腮腺腺体的萎缩，100 d后MEC数量快速减少，150 d时接近正常水平。此外，MEC在腮腺萎缩过程中的形态变化，可对判断腺体萎缩程度及选择治疗时机提供理论依据。通过研究MEC在腮腺萎缩过程中的转归规律，对唾液腺辐射防护及腺体萎缩的治疗具有积极的指导意义。

[参考文献]

[1] Burgess KL， Dardick I， Cummins MM， et al. Myoepithelial cells

actively proliferate during atrophy of rat parotid gland[J]. Oral Surg

Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod， 1996， 82（6）：674-680.

[2] Lung MA. Autonomic nervous control of myoepithelial cells and

secretion in submandibular gland of anaesthetized dogs[J]. J Phy-

siol， 2003， 546（Pt 3）：837-850.

[3] Burgess KL， Dardick I. Cell population changes during atrophy

and regeneration of rat parotid gland[J]. Oral Surg Oral Med Oral

Pathol Oral Radiol Endod， 1998， 85（6）：699-706.

[4] Carpenter GH， Osailan SM， Correia P， et al. Rat salivary gland

ligation causes reversible secretory hypofunction[J]. Acta Physiol