趋化因子受体CXCR4及其配体CXCL12在口腔鳞状细胞癌细胞增殖和迁移中的作用

尹东　张佐　高素等

[摘要] 目的 检测趋化因子受体CXCR4及其配体CXCL12在口腔鳞状细胞癌细胞中的表达及其在肿瘤细胞增殖和迁移中的作用。方法 采用逆转录聚合酶链式反应和Western blot法检测20例口腔鳞状细胞癌组织、颈部淋巴结组织、舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113、颊鳞状细胞癌细胞株Bca885和10例正常口腔黏膜组织中CXCR4的表达，采用逆转录聚合酶链式反应检测CXCL12的表达，通过MTT法检测细胞的增殖能力，通过趋化实验观察CXCR4特异性配体CXCL12对口腔鳞状细胞癌细胞的趋化迁移作用。结果 1）在口腔鳞状细胞癌组织、Tca8113细胞及Bca885细胞中，CXCR4 mRNA的相对表达量分别为2.31±1.13、1.89±1.20、1.67±1.10，CXCR4蛋白的相对表达量分别为1.36±0.15、1.85±0.34、1.97±0.23，正常口腔黏膜组织在mRNA及蛋白质水平均未检测到CXCR4表达。口腔癌患者颈部淋巴结组织中，CXCL12 mRNA表达量的平均值为1.14±0.87，而口腔鳞状细胞癌组织和正常口腔黏膜组织未检测出CXCL12的表达。2）口腔鳞状细胞癌细胞在CXCL12作用下增殖反应明显增强，CXCR4抗体可明显抑制肿瘤细胞的增殖。3）趋化实验显示CXCL12可诱导口腔鳞状细胞癌细胞发生明显迁移，在30～100 ng·mL-1的范围内，诱导口腔鳞状细胞癌细胞迁移的作用呈明显量效关系。结论 CXCR4/CXCL12受体配体系统可介导口腔鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移，在癌细胞向颈部淋巴结转移中发挥着重要作用。

[关键词] 口腔鳞状细胞癌； 趋化因子受体； 增殖； 迁移

[中图分类号] R 730.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.01.003 口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是发生于口腔黏膜的鳞状细胞癌，具有局部侵袭力强且易向颈部淋巴结转移的特点，而颈部淋巴结转移对患者的预后影响很大。趋化因子是一种能够结合到靶细胞上的特异性G蛋白偶联受体的化学诱导因子，参与调节生理性和病理性白细胞迁移。研究[1]发现，趋化因子及其受体与肿瘤侵袭、转移密切相关，尤其是趋化因子受体CXCR4及其配体CXCL12相互作用所构成的反应轴在多种肿瘤的发生、增殖、分化和器官特异性转移中发挥着重要作用[2-4]。已有研究[5-7]表明，不同的肿瘤细胞可表达趋化因子受体CXCR4，而其配体CXCL12则高表达于癌细胞转移相关部位。它们不仅与肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭密切相关，而且有可能成为肿瘤治疗的一个新靶点。本课题组在以前的实验[8]中已经证实，趋化因子受体

CXCR4在口腔鳞状细胞癌中有表达，并与口腔鳞状细胞癌淋巴结转移有关。为了进一步了解趋化因子受体CXCR4及其配体CXCL12在口腔鳞状细胞癌细胞增殖和迁移中的作用，本研究检测了口腔鳞状细胞癌组织、舌癌细胞株Tca8113、颊癌细胞株Bca885中CXCR4以及口腔鳞状细胞癌组织及其颈部淋巴结组织中CXCL12的表达，并对其增殖、趋化和迁移活性进行相应分析，以期为CXCR4和CXCL12诱导口腔鳞状细胞癌细胞定向迁移提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象和标本来源

1.1.1 细胞株和主要试剂 口腔鳞状细胞癌细胞株Tca8113和Bca885均购自四川大学口腔疾病研究国家重点实验室，用含10%新生小牛血清（fetal bovine serum，FBS）的RPMI1640培养液培养。二甲基亚砜

（dimethyl sulfoxide，DMSO）、MTT液（Sigma公司，美国）；鸟类成髓细胞白血病病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）逆转录酶、Taq NDA多聚酶（Takara公司，日本）；CXCL12（Cytolab公司，美国）、兔抗人CXCR4抗体（R&D;公司，美国）。趋化小室与8.0 μm孔径多聚碳酸酯膜（Neutroprobe公司，美国）。

1.1.2 临床标本 选取2010年7月至2011年7月在宁夏回族自治区人民医院住院手术治疗的20例口腔鳞状细胞癌患者，采集标本进行研究。20例患者中，男性13例，女性7例；年龄19～81岁，平均60岁；按国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，

UICC）（2002年）标准进行分期，Ⅱc期4例，Ⅲa期7例，Ⅲb期4例，Ⅲc期5例。20例患者中，分别取其颈部淋巴结组织各1枚（共20枚），其中14枚为转移淋巴结组织；另取其中10例正常口腔黏膜组织同时进行研究。所有标本均经术后病理学检查和验证。

1.2 方法

1.2.1 标本的采集 在手术中无菌收集口腔癌患者的口腔鳞状细胞癌组织、颈部淋巴结组织和正常口腔黏膜组织，置液氮中保存。

1.2.2 CXCR4和CXCL12 mRNA表达水平的测定 将口腔鳞状细胞癌组织、颈部淋巴结组织和正常口腔黏膜组织匀浆，与Tca8113和Bca885细胞一起，均用TRIzol试剂一步法提取组织和细胞中的总RNA。用AMV逆转录酶进行逆转录聚合酶链式反应（polyme-

rase chain reaction，PCR）扩增CXCR4和CXCL12，同时扩增β-actin作为内参照。CXCR4引物序列为：正义链5-AGCTGTTGGTGAAAAGGTGGTCTATG-3，反义链5-GCGCTFCTGGTGGCCCTTGGAGTGTG-3；CXCL12引物序列为：正义链5-CCGCGCTCTGCC-TCAGCGACGGGAAG-3，反义链5-CTTGTTTAA-AGCTTTCTCCAGGTACT-3。CXCR4和CXCL12 PCR产物的扩增长度分别为260 bp和227 bp。以上引物均由上海亚法生物工程公司合成。PCR反应条件：94 ℃变性30 s，56 ℃退火3 s，72 ℃延伸30 s，共33个循环，最后再72 ℃延伸10 min后结束反应。PCR产物经15%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照，利用投射仪图像分析系统扫描，确定条带的光密度值。整个逆转录PCR过程独立重复3次，以3次实验所得光密度值的平均数表示mRNA相对表达量。

1.2.3 Western blot分析 将同样大小口腔鳞状细胞癌组织及正常口腔黏膜组织匀浆，以细胞裂解液将组织匀浆及细胞裂解，参照文献[9]的方法提取蛋白质。取80 μg蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE），转膜，室温封闭

1 h后，加入含0.05% Tween 20的TBS缓冲液稀释的CXCR4兔抗人单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，TBS缓冲液漂洗3次后，加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1 000），37 ℃温育1 h，增强化学发光系统显色。利用投射仪图像分析系统扫描确定X线片上杂交条带的光密度值。实验独立重复3次，以3次实验所得光密度值的平均数表示蛋白质的含量。

1.2.4 MTT法测定细胞增殖 收集Tca8113细胞，加入96孔板（每100 μL含1×104个细胞）。实验设置4组：1组为对照组，Tca8113细胞加RPMI1640培养液；2组为CXCL12刺激组，Tca8113细胞加RPMI1640培

养液、100 ng·mL-1 CXCL12；3组为CXCL12中和组，Tca8113细胞用CXCR4中和抗体（50 μg·mL-1）作用

30 min后加RPMI1640培养液、100 ng·mL-1 CXCL12；4组为CXCR4抑制组，加入RPMI1640培养液、

15 μg·mL-1 CXCR4。4组分别于培养24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，继续孵育4 h后终止培养，吸弃孔内培养液，每孔加入150 μL DMSO，使结晶

物充分溶解后，以490 nm波长处各孔的光密度值表示细胞的增殖情况。

1.2.5 趋化实验 参照文献[10]的方法用48孔趋化小

室检测人重组CXCL12对CXCR4阳性口腔癌细胞的趋化作用。下室各加入不同质量浓度（10～150 ng·mL-1）

的重组人CXCL12，同时以无趋化因子的培养基作阴性对照；每组均设3个复孔。上室加入口腔鳞状细胞癌细胞悬液，上下室之间铺多聚碳酸酯膜。将趋化小室置于37 ℃含5%CO2孵箱中孵育4 h，然后以PBS棉签拭去膜背面的细胞，70%甲醇固定，苏木精染色，置于光镜下计数至少5个视野（放大200倍）的细胞数。计算趋化指数，即迁移到含有不同质量浓度趋化因子液体膜侧的细胞数与迁移到阴性对照液膜侧的细胞数的比值，以趋化指数的大小表示趋化活性的高低。实验独立重复3次。

1.3 统计学处理

采用SPSS 10.0统计软件包进行统计分析，组间方差齐时采用t检验，方差不齐时采用非参数Mann-Whitney检验，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 CXCR4和CXCL12 mRNA水平的表达

口腔鳞状细胞癌Tca8113细胞以及Bca885细胞CXCR4的mRNA相对表达量分别为1.89±1.20和1.67±1.10；20例口腔鳞状细胞癌组织表达CXCR4 mRNA的相对表达量为2.31±1.13，与临床分期无明显相关性（r=0.1，P>0.5）；10例正常口腔黏膜组织未检测

出CXCR4 mRNA的表达。口腔鳞状细胞癌患者颈部淋巴结组织中CXCL12 mRNA表达率为75%（15/20），其相对表达量为1.14±0.87，而口腔鳞状细胞癌组织、口腔鳞状细胞癌细胞株和正常口腔黏膜组织未检测出CXCL12 mRNA的表达。CXCR4和CXCL12 mRNA的电泳结果见图1。

1：DNA Marker；2：正常口腔黏膜组织；3：口腔鳞状细胞癌组织；4：Tca8113细胞；5：Bca885细胞；6：淋巴结组织。

Fig 1 Expression of CXCR4和CXCL12 mRNA in different cell

lines and tissues

2.2 CXCR4蛋白的表达

20例口腔鳞状细胞癌组织均可检测到CXCR4蛋白的表达，相对表达量为1.36±0.15；Tca8113和Bca885细胞的CXCR4蛋白相对表达量分别为1.85±0.34和1.97±0.23；10例正常口腔黏膜组织未检测出CXCR4蛋白的表达。CXCR4蛋白的Western blot分析见图2。

Fig 2 Expression of CXCR4 protein in different cell lines and

tissues

2.3 CXCR4/CXCL12反应轴在Tca8113细胞增殖中的

作用

MTT法测量细胞增殖的结果见表1。作用24、48 h时CXCL12刺激组Tca8113细胞的增殖无明显变化，作用72 h后细胞的增殖反应明显增强，CXCL12刺激组的细胞数明显高于对照组，差异有统计学意义（P<

0.01）。作用72 h后，CXCL12中和组的细胞数明显低于CXCL12刺激组，差异有统计学意义（P<0.05），可见预先孵育CXCR4抗体可以对抗CXCL12的促增殖作用。CXCR4抑制组在24、48、72 h时的细胞数均明显低于对照组（P<0.01），可见CXCR4抗体本身对Tca8113细胞的增殖也有明显的抑制作用。

2.4 重组CXCL12对Tca8113细胞趋化和迁移的影响

当趋化小室的下室未加入CXCL12趋化因子时，Tca8113细胞迁移的数目分别为10个左右，当下室加入10～150 ng·mL-1的CXCL12后，迁移的细胞数明显增加，分别为12.41±4.20、18.64±3.25、29.57±5.24、33.63±5.34、29.35±5.27，其趋化指数见图3。在30～100 ng·mL-1范围内，CXCL12诱导Tca8113细胞的趋化迁移呈剂量依赖关系，达到最大迁移效果的CXCL12质量浓度为100 ng·mL-1。

Fig 3 Chemotactic indices of oral squamous cell carcinoma cells

in response to different concentrations of CXCL12

3 讨论

肿瘤的侵袭、转移是一个具有高度组织性和器官选择性的多因素、多步骤的过程。虽然已证明很多因素参与了肿瘤的侵袭和转移，但不同组织来源的肿瘤细胞迁徙到特定部位的分子机制还不清楚。趋化因子能够调控细胞的迁移，特别是在免疫和炎症反应中诱导白细胞迁移。CXCL12是CXC亚家族成员，可与其唯一的跨膜受体CXCR4相互作用。有研究[11]显示，淋巴管内皮细胞通过分泌趋化因子吸引

肿瘤细胞，进而主动性促进肿瘤细胞的淋巴转移，这一过程类似于免疫刺激过程中树突状细胞的正常迁移。在肿瘤细胞定向迁移的过程中，趋化因子通过与肿瘤细胞表面相应的受体相互作用，诱导肿瘤细胞骨架重排，促使肿瘤细胞紧密黏附于淋巴管内皮细胞，最终实现定向性迁移[11]。还有研究[12-14]表明，不同的肿瘤细胞中可表达趋化因子受体CXCR4，而其唯一的配体CXCL12在淋巴结、骨髓、肺等转移的好发部位中表达水平极高，CXCR4与CXCL12相互作用与许多肿瘤的发生、生长和转移密切相关。通过逆转录PCR，本研究检测到在口腔鳞状细胞癌组织、Tca8113及Bca885细胞中有CXCR4 mRNA及蛋白的相对表达，而在正常口腔黏膜组织中则无表达；同时，在口腔鳞状细胞癌患者颈部淋巴结组织中还检测到了CXCL12 mRNA的高表达，而在口腔鳞状细胞癌组织、口腔鳞状细胞癌细胞株和正常口腔黏膜组织中未见CXCL12 mRNA表达，这说明CXCR4/CXCL12的相互作用可能在口腔鳞状细胞癌的侵袭和颈部淋巴结转移中起着重要作用。

CXCR4/CXCL12与肿瘤细胞的增殖也有重要关系。本研究通过MTT法检测细胞增殖，发现口腔鳞状细胞癌细胞在CXCL12作用24、48 h后增殖反应不明显，72 h后才明显增强。这与Kang等[15]报道的CXCL12在短期内刺激细胞增殖不明显而后期效果显著的结论相一致。CXCL12的空间结构受微环境，如pH值、磷酸盐、硫酸盐、肝素浓度等，特别是pH值的调节；CXCL12在酸性条件下呈可溶性单体，中性或偏碱性时则呈结晶二聚体[16]。随着CXCL12作用时间的延长，肿瘤细胞生长使微环境pH值下降，CXCL12活性增加，导致CXCL12在短期内刺激细胞增殖不明显而后期的刺激效果显著。本研究还发现，预先用CXCR4抗体结合细胞膜上的CXCR4受体可不同程度地中和CXCL12，抑制CXCL12对鳞状细胞癌细胞的促增殖作用；同时CXCR4抗体本身对鳞状细胞癌细胞的增殖也有明显的抑制作用。Bertolini等[17]报道：用CXCR4

单克隆抗体中和非霍奇金淋巴瘤细胞的CXCR4蛋白，可减弱瘤细胞的增殖并促进瘤细胞凋亡，这表明细胞膜表面CXCR4受体起到的不仅仅是与特异性配体CXCL12结合的作用，还可以激活一系列信号通路，引起肿瘤细胞的一系列变化[18]。本研究结果也间接

表明CXCR4在肿瘤细胞增殖中的作用不容忽视。

癌细胞的定向迁移和侵袭是肿瘤转移的关键步骤。Müller等[2]发现：人乳腺癌细胞表达CXCR4受体，而正常乳腺上皮细胞不表达；其配体CXCL12在淋巴结、骨髓、肺等好发的转移部位的表达水平极高。该研究[2]结果表明：乳腺癌细胞表达CXCR4，能与

CXCL12结合导致肌动蛋白聚合及伪足形成，随后出现化学趋向性和侵润反应；而通过特异性抗体阻断CXCR4能抑制乳腺癌细胞的定向迁移和侵袭。本实验发现，CXCL12在30～100 ng·mL-1范围内能够诱导口腔鳞状细胞癌细胞发生迁移运动，且该作用呈明显的量效关系。这提示口腔鳞状细胞癌细胞可通过表达有功能活性的趋化因子受体CXCR4，与CXCL12相互作用后可诱发细胞与肌动蛋白聚合相关的伪足形成、定向性迁移和侵袭，实现肿瘤细胞向淋巴结的转移。

综上所述，CXCR4/CXCL12受体配体系统可介导口腔鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移，可能与口腔鳞状细胞癌的发生、发展和淋巴结转移有关，干扰CXCR4/CXCL12的相互作用有可能成为治疗口腔鳞状细胞癌的一个有意义的靶点和策略。

[参考文献]

[1] Nathanson SD. Insights into the mechanisms of lymph node me-

tastasis[J]. Cancer， 2003， 98（2）：413-423.

[2] Müller A， Homey B， Soto H， et al. Involvement of chemokine re-

ceptors in breast cancer metastasis[J]. Nature， 2001， 410（6824）：

50-56.

[3] Liang Z， Brooks J， Willard M， et al. CXCR4/CXCL12 axis pro-

motes VEGF-mediated tumor angiogenesis through Akt signaling

pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2007， 359（3）：716-

722.

[4] Ao M， Franco OE， Park D， et al. Cross-talk between paracrine-

acting cytokine and chemokine pathways promotes malignancy in

benign human prostatic epithelium[J]. Cancer Res， 2007， 67（9）：

4244-4253.

[5] 王晓翊， 卢实， 林晓琰， 等. SDF-1/CXCR4对卵巢上皮性癌细胞

增殖和侵袭的影响[J]. 现代妇产科进展， 2008， 17（4）：254-258.

Wang Xiaoyi， Lu Shi， Lin Xiaoyan， et al. Effects of chemokine

SDF-1/CXCR4 on proliferation and invasion of ovarian carcinoma

cell[J]. Progress Obstetrics Gynecology， 2008， 17（4）：254-258.

[6] 沈晓燕， 王绍海， 汪宏波， 等. CXCR4及其配体SDF-1α在卵巢癌

SKOV3细胞黏附和侵袭中的作用[J]. 肿瘤， 2009， 29（9）：852-856.

Shen Xiaoyan， Wang Shaohai， Wang Hongbo， et al. The role of

CXCR4 and its ligand SDF-1α in the process of adhesion and

invasion of ovarian cancer[J]. Tumor， 2009， 29（9）：852-856.

[7] Katayama A， Ogino T， Bandoh N， et al. Expression of CXCR4 and

its down-regulation by IFN-gamma in head and neck squamous

cell carcinoma[J]. Clin Cancer Res， 2005， 11（8）：2937-2946.

[8] 尹东， 高志. 趋化因子受体CXCR4在口腔鳞状细胞癌中的表达及

其临床意义[J]. 华西口腔医学杂志， 2007， 25（4）：392-395.

Yin Dong， Gao Zhi. Expression and clinical significance of che-

mokine receptor 4 in oral squamous cell carcinoma[J]. West China

J Stomatol， 2007， 25（4）：392-395.

[9] 汪家政， 范明. 蛋白质技术手册[M]. 北京： 科学出版社， 2000：20-

23.

Wang Jiazheng， Fan Ming. Handbook of protein technology[M]. Bei-

jing： Science Press， 2000：20-23.

[10] Yamaguchi N， Anand-Apte B， Lee M， et al. Endostatin inhibits

VEGF-induced endothelial cell migration and tumor growth inde-

pendently of zinc binding[J]. EMBO J， 1999， 18（16）：4414-4423.

[11] Kim CH. The greater chemotactic network for lymphocyte traffic-

king： Chemokines and beyond[J]. Curr Opin Hematol， 2005， 12

（4）：298-304.

[12] 王磊， 李健文， 冯波， 等. 趋化因子受体CXCR4在结肠直肠癌中

的表达及意义[J]. 外科理论与实践， 2009， 14（2）：189-192.

Wang Lei， Li Jianwen， Feng Bo， et al. The expression of chemo-

kine receptor CXCR4 in colorectal cancer and its clinical signi-

ficance[J]. J Surgery Concepts Practice， 2009， 14（2）：189-192.

[13] 蔡剑， 王佳， 魏强， 等. 趋化因子受体CXCR4在膀胱移行细胞癌

中的表达[J]. 中国中西医结合外科杂志， 2008， 14（1）：7-11.

Cai Jian， Wang Jia， Wei Qiang， et al. Expression of chemokine

receptor CXCR4 in bladder transitional cell carcinoma[J]. Chinese

J Surgery Integrated Traditional Western Medicine， 2008， 14（1）：

7-11.

[14] 姜建勇， 平轶芳， 赵林涛， 等. 趋化因子受体CXCR4活化促进人

胶质瘤干细胞迁移及其机制探讨[J]. 肿瘤， 2009， 29（5）：409-412.

Jiang Jianyong， Ping Yifang， Zhao Lintao， et al. Activation of che-

mokine receptor CXCR4 promoted glioma stem cells migration and

its mechanism[J]. Tumor， 2009， 29（5）：409-412.

[15] Kang H， Mansel RE， Jiang WG. Genetic manipulation of stromal

cell-derived factor-1 attests the pivotal role of the autocrine SDF-

1-CXCR4 pathway in the aggressiveness of breast cancer cells[J].

Int J Oncol， 2005， 26（5）：1429-1434.

[16] Veldkamp CT， Peterson FC， Pelzek AJ， et al. The monomer-dimer

equilibrium of stromal cell-derived factor-1（CXCL 12） is altered

by pH， phosphate， sulfate， and heparin[J]. Protein Sci， 2005， 14

（4）：1071-1081.

[17] Bertolini F， DellAgnola C， Mancuso P， et al. CXCR4 neutraliza-

tion， a novel therapeutic approach for non-Hodgkins lymphoma

[J]. Cancer Res， 2002， 62（11）：3106-3112.

[18] Uchida D， Begum NM， Almofti A， et al. Possible role of stromal-

cell-derived factor-1/CXCR4 signaling on lymph node metastasis

of oral squamous cell carcinoma[J]. Exp Cell Res， 2003， 290（2）：

289-302.

（本文采编 陈谦明）