超细氯化钠粉的BALB/C 小鼠骨髓微核实验

吴占敖，范利娟，许华君，端礼荣

(1.解放军第359 医院口腔科，江苏 镇江212001;2.解放军第359 医院呼吸内科，江苏 镇江212001;3.中国盐业总公司镇江盐化公司，江苏 镇江212001;4.江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏 镇江212013)

气溶胶盐疗法是最近几年从俄罗斯引进的一种控微气候物理治疗方法，其特点是利用干燥NaCl微粒气雾在仿盐矿气候的环境内造成最佳的温湿度条件，通过患者吸入而发挥其治疗作用。目前，该法已作为一种治疗哮喘、支气管炎症等呼吸道疾病的新型非药物方法应用于临床。其中发挥治疗作用的是5 ～8 μm 大小的干燥氯化钠气雾颗粒［1]。为保障人体用药安全，需要确定超细氯化钠粉的安全性。小鼠骨髓微核试验是药品注册技术规范国际协调会(International Conference on Harmonization，ICH)推荐的检测致突变物质标准实验，以小鼠骨髓嗜多染红细胞(polychromatic erythrocyte，PCE)中的微核数目作为评价化学物质毒性的指标，具有经济、快速、准确的特点［2-5]。本研究对BALB/c 小鼠连续予不同浓度的超细氯化钠粉(pM 2.5-10)灌胃后，观察小鼠骨髓细胞的毒性反应，并通过计算骨髓细胞的微核率，对超细氯化钠粉进行安全毒理学评价。

1 材料与方法

1.1 材料

超细氯化钠粉(pM2.5-10)为白色颗粒，溶于水，由江苏省金坛盐矿提供。环磷酰胺(CP)由上海华联制药有限公司生产;姬姆萨染液为上海江莱生物科技有限公司产品。

1.2 动物

6 ～8 周龄BALB/c 小鼠，雌性，清洁级，体质量18 ～20 g，由扬州大学比较医学中心提供。自由摄水，室温(24 ±2)℃，湿度45% ～65%，适应性喂养3d 后进行试验。

1.3 小鼠急性毒性试验

小鼠50 只，在预试验基础上，随机分为3 个剂量组，超细氯化钠粉剂量范围为高、中、低(5.0、2.5、1.25 mg/kg)，另设正常对照组、阳性对照组，共5 组，每组10 只，试验前禁食6 h，其中3 个剂量组经口灌服不同浓度的超细氯化钠粉溶液，连续观察14d，阳性对照组给予腹腔注射环磷酰胺(CP)40 mg/kg，正常对照组采用腹腔注射生理盐水。记录小鼠中毒表现及死亡情况。

1.4 小鼠骨髓细胞微核试验

选用体质量18 ～20 g 雌性小鼠50 只，随机分为5 组，每组10 只，超细氯化钠粉剂量组(试验组)经口灌服，给药量分别为5.0、2.5、1.25 mg/kg，阳性对照组环磷酰胺的给药量为40 mg/kg，采用腹腔注射，正常对照组采用腹腔注射生理盐水。多次染毒，每天染毒1 次，连续5d，末次染毒后6 h 后用颈椎脱臼法处死小鼠，取股骨或取胸骨，擦净血污，剔去肌肉，剪去每节骨骺，用小型弯止血钳取骨髓涂片，固定，Giemsa 染色。在低倍显微镜下选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域，用油镜观察，每张涂片计数约1000 个胞质清晰完整的嗜多染红细胞(PCE)的微核率，结果以千分率(‰)表示。

1.5 统计处理

应用SPSS 16.0 统计软件进行分析，微核率均以¯±s表示，采用单因素方差分析及χ2检验进行统计学处理，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠急性毒性及一般观察试验

由表1 可知，小鼠经口灌服不同剂量的超细氯化钠粉后，5.0 mg/kg 组小鼠活动稍减弱，部分小鼠出现食欲稍减低，体质量在第2 天开始下降，但初始体质量(g)与5 天体质量(g)比较无明显变化。2.5 mg/kg 组和1.25 mg/kg 组的体质量均无变化，与对照组比较，各超细氯化钠粉处理组体质量均无明显差异(P＞0.05)。各组均无小鼠死亡，小鼠生长良好。阳性对照组(CP)体质量减轻明显(P＜0.05)。

表1 各组小鼠体质量的变化Tab 1 Changes of body weight in every group

2.2 小鼠骨髓细胞微核率的变化

阳性对照组(CP)微核细胞率为(111.6 ±25.5)‰，超细氯化钠粉5.0 mg/kg 组微核细胞率为(13.7 ±2.89)‰，2.5 mg/kg 组为(9.1 ±2.99)‰，1.25 mg/kg 组为(8.2 ±3.05)‰，而正常对照组微核细胞率为(5.9 ±1.66)‰。与正常对照组比较，环磷酰胺组微核率明显增高，差异有统计学意义(χ2=25.6，P＜0.001)。超细氯化钠粉各剂量组间微核细胞数比较，差异无明显统计学意义(P＞0.05)。超细氯化钠粉各组与正常对照组比较，差异无明显统计学意义(P＞0.05)，说明超细氯化钠粉对小鼠骨髓PCE 无致突变作用。见图1。

图1 各组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核数(油镜×400)Fig 1 Numbers of bone marrow micronucleus of mice

3 讨论

无着丝粒的染色体片段或因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期仍留在子细胞的胞质内成为微核。这种情况的出现往往是受到染色体断裂剂作用的结果［7]。微核试验是检测染色体或有丝分裂器损伤的一种遗传毒性试验方法。微核试验作为检测染色体损伤最常用而有效的细胞遗传学检测方法之一，已被当今多国和国际组织列为诱变试验的常规方法，并将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理学安全性评价的必做试验［8]。近年来，盐疗的应用领域不断拓展，一些知名的研究机构已加入到盐疗技术的开发过程中。本课题组前期实验结果已显示，天然矿盐粉吸入疗法能改善哮喘小鼠肺部炎症［9]，本试验进一步观察超细NaCl 对小鼠的遗传毒性，通过小鼠急性毒性、一般观察试验及微核试验，未显示超细氯化钠粉对小鼠具有明显毒性，特别是骨髓嗜多染红细胞微核率未见明显增加，表明在试验剂量范围内，超细氯化钠粉无致突变性。本次实验结果为将盐粉应用于呼吸道疾病的治疗提供了实验依据。

［1]余璞，余健民.盐雾疗法的进展［J]. 江西医药，2010，45 (10):1053-1055.

［2]傅鹏，张宗鹏. 新药评价中遗传毒性试验方法学研究及其发展趋势［J]. 天津药学，2004，16 (5):43-46.

［3]黄芳华. ICH 遗传毒性标准试验组合的最新要求［J].药物评价研究，2009，32 (1):10-12.

［4]黄芳华. ICH 遗传毒性结果评价和追加试验策略指导原则介绍［J]. 药物评价研究，2009，32 (2):81-83.

［5]李宏. 微核实验的研究进展［J]. 安徽农业科学，2009，37 (7):2864-2866.

［6]王磊.聚肌胞毒理学和药效学的初步研究［D]. 南京:南京农业大学，2007:28-42.

［7]Dohil MA，Lin P，Lee J，et al.The epidemiology of molluscum contagiosum in chidren［J]. J Am Acad Dermatol，2006，54(1):47-54.

［8]Kirkland DJ，Henderson L，Marzin D，et al. Testing strategies in mutagenicity and genetic toxicology:an appraisal of the guidelines of the European Scientific Committee for Cosmetics and Non-Food Products for the evaluation of hairdyes［J].Mut Res，2005，588(2):88-105.

［9]范利娟，许华君，吴占敖，等.矿盐粉粒吸入疗法对哮喘小鼠肺组织病理形态及血清IL-4、IL-5、IL-13 水平的影响［J].江苏大学学报:医学版，2012，22(5):374-377.