生物学研究领域值得关注的技术

奇云

在2013年乃至未来几年内，生物学研究领域重要技术发展有哪些？对此，世界著名科学杂志《自然-方法》（Nature Methods）邀请生物科学和相关学科的专家进行研讨，得出的结论是：纳米孔测序、微生物组功能研究、近红外荧光成像、钻石氮空泡中心成像、构建干细胞体外微环境、快速容积成像、蛋白复合体无损质谱鉴定和机器自动分辨表型等8大技术值得关注。

NO.1

纳米孔测序

近年来，激烈的竞争使得DNA测序技术迅猛发展。现在，一种叫做纳米孔测序的技术犹如一匹黑马闯入大家的视线，看起来很有潜力在竞争中拔得头筹。

纳米孔测序技术，是借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，在测序过程中起始DNA不会被破坏，所以测序的准确度非常高。错误率目前介于1%～4%之间，并且是随机分布的，而不是扎堆在读取序列的两端。

纳米孔测序技术还有一个非常吸引人的优势，那就是测序距离长。从原则上来说，使用纳米孔测序技术，只要DNA链不发生断裂，并且能一直通过纳米孔，就可以一直检测下去。对于长达1000个碱基的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记，就可以使用纳米孔测序技术进行检测。

这种先进的技术有可能将完整测出人类基因组的费用降低到1000美元以下，为个体化医疗带来革命，并将基于遗传学的诊疗及医学带入新的时代。《自然-方法》杂志在介绍纳米孔测序时，使用了“具有颠覆性的技术”一词来形容。在2012年基因组生物科学与技术进展研讨会上，牛津纳米孔科技公司宣布将推出第一款商品化的纳米孔测序仪，随即引起了科学界的广泛关注。专家们预测，纳米孔测序技术有望弥补现有测序平台所存在的缺陷。

NO.2

微生物组功能研究

随着高并行测序技术和高通量质谱技术的发展，微生物学已经进入了一个新时代，从单菌株的分离研究时代进入微生物群落整体研究时代。微生物组是指微生物的总和，包括在一个特定的环境中所有微生物的遗传物质及其与环境之间的相互作用。这个特定的环境，可以是人的胃，或是一份土壤样品。

人体内有两个基因组，一个是从父母那里遗传来的人基因组，编码大约2.5万个基因；另一个则是出生以后才进入人体的多达1000多种的共生微生物，其遗传信息的总和叫“微生物组”，它们所编码的基因有100万个以上。在研究基因与人体健康关系时，一定不能忽略共生微生物组功能的研究。为此，美国推出了“人类微生物组计划”项目，欧盟也推出了相应的“人类肠道宏基因组学计划”。另外，法国、日本、加拿大等国还单独为微生物组学研究设立了专项。2012年，人类微生物组计划首次全面精确地公布了人类正常微生物构成，并创建了一个庞大的参考数据库，这将加速传染病研究的进程。

微生物组功能研究技术的发展，将打破医学微生物和环境微生物之间的界限，不仅能够为处理医学问题、疾病治疗提供新思路和新方法，还能让人们根据个人生理特点及饮食习惯，来控制自己体内微生物组成，从而改善健康状况，甚至治疗疾病。

NO.3

近红外荧光成像

生物活体内的血红蛋白、水和脂质对光谱范围大约在650纳米–900纳米的近红外荧光的吸收系数最低，进而与可见光相比近红外荧光可穿透更深层的组织。近红外荧光成像的基本原理是以特定波谱范围的激发光源照射荧光分子（近红外荧光探针），此时荧光分子被激发出不同光谱特性的光子信号，此信号通过滤光片后由超敏CCD照相机采集，然后通过高级数据处理技术将光子信号转换为图像。

通过活体动物近红外荧光成像，可以观测到疾病或癌症的发展进程以及药物治疗所产生的反应，并因为近红外线荧光成像中高特异性的智慧探针可以反映机体某些特殊酶类的活动情况，所以该技术可用来检测体内或体外的某些酶的表达，即可用于基因治疗的疗效评定和特殊标记基因的显像，以及用于肿瘤的生长、血管生成、转移中特殊酶类的活动情况的监测等。这项新型的成像技术还可用于风湿性关节炎和类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、血栓形成等疾病的研究。

近红外荧光成像的核心是近红外探针。目前，近红外探针有很多种，包括靶定的近红外荧光染料、活性的近红外荧光染料、红移的荧光蛋白和生物荧光探针等等。近红外荧光成像技术的未来发展主要为各种特异靶向探针和聪明探针的合成，并将其应用于不同疾病的实验性研究，且主要集中于肿瘤、炎症和心血管疾病的早期诊断及疗效的动态监测，从分子水平为疾病的发生、发展、转归提供信息。

NO.4

钻石氮空泡中心成像

对于生物学家而言，钻石的最大用途，来自于钻石的有特定缺陷、高度规整的碳晶格结构。这种所谓的缺陷，指的是在碳晶格结构中有一些氮原子附近缺失了一些碳原子，这就形成了所谓的“氮空泡中心”。不过，这种不完美的结构却能够发出不容易被光猝灭的荧光，而且只有4纳米大小的钻石同样具备这种特性。再加上钻石是由碳原子构成的，所以也具有极佳的生物相容性。

现在，纳米钻石已经被用于活体动物成像当中，主要被当作探针使用。在超高分辨率显微镜下，这些钻石还表现出了非常优异的定位精确性。不过这些钻石现在还不太能够用作细胞探针，因为它们还不如其他的遗传学探针好用，但是正在开发的功能和靶向技术有望改变这一现状。在荧光共振能量转移过程中，氮空泡中心是一种高效的染料受体分子供体，而且可以被用来开发出各种新型的感受器。

不过氮空泡中心最吸引人的潜在用途，还是来自其异常的电子自旋状态。这种电子自旋态对于磁场非常敏感，而且还能够发射荧光，通过荧光显微镜就可以观察到这种荧光。在原子力扫描显微镜上使用一个氮空泡中心，就可以得到一幅非常漂亮的磁场照片。将这种技术进一步小型化之后，就可以得到一款微型的台式核磁共振成像仪，它能方便地对单分子蛋白质进行结构测定。

NO.5

重建干细胞体外微环境

人体内的各种干细胞都有适合它们各自需求的生存微环境，这种微环境被称作微生态系统，是确保干细胞能够发挥出正常功能的关键。所以，科研人员对于干细胞与所在位置微环境之间的关系非常感兴趣。其中有一个研究方向，就是希望在体外细胞培养环境中，重建出适合干细胞生存的微环境。

科学家们之所以想要在体外细胞培养环境中，复制适合干细胞生存的微环境有两个目的。首先，有了这种适宜干细胞生长的条件，就可以在体外对干细胞进行大规模的培养。其次，这还有利于科学家了解干细胞与微环境之间的相互作用关系，同时还可以通过改变微环境与干细胞之间的相互作用方式来构建干细胞病理模型。

在重建干细胞体外培养微环境时，有一种相对比较简单的方式可供选择，那就是对干细胞和间质细胞，或者其他在体内就位于干细胞周围的细胞进行共同培养。不过，要完全复制出这样一套和体内真实环境一样复杂的、能够发生动态变化的干细胞生活微生态系统，还不是那么容易的。因为虽然构成微环境的其它因素都差不多，比如可溶性的信号分子、粘附信号分子、细胞间的相互作用、细胞与胞外基质之间的相互作用、构成微生态立体结构的机械力以及代谢产物、氧气等受到系统调控的其他因素等，但是适应每一种干细胞生存的微环境在细节上都会有一些差别。

NO.6

快速容积成像

对生物样品进行的三维荧光成像操作，通常都是依靠多次拍摄之后将多个二维图像叠加的方式完成的。不过这种方式费时费力，而且并不适合记录瞬间的图像，同时也不太适用于拍摄对光敏感的样品。快速容积成像新技术采用的则是另外一种策略，使用这种技术可以只通过一次拍摄就得到一幅完整的三维图像。美国斯坦福大学的科学家之前也曾经设计了一台能够拍摄立体照片的光场显微镜。这种显微镜其实就是在传统光学显微镜的主镜片和传感器之间又加上了一组显微透镜。在传统显微镜中原本会穿过焦点的光线，到了这台光场显微镜下，会转而穿过那组显微透镜。这些光线然后分别会被光场检测板记录下来，这样被拍摄样品中的每一个不同的点，都会以不同图像的方式被记录下来。然后再用重叠合算法对图像进行处理，最终每一幅图像都会是一幅三维立体透视图像。

这种显微镜拍摄的三维图像包含了足以满足我们需要的信息。斑马鱼幼体大脑中钙荧光蛋白分布三维图像就是个很好的例子。日本国立遗传学研究所的科研人员在通体透明的斑马鱼幼鱼身上进行了测试。他们搭建起液晶显示屏，用以向静止的斑马鱼幼鱼的一侧展示闪烁的点。随着点的出现和消失，研究人员观察到相应的闪光自斑马鱼的顶盖位置发出，而这反映了它的神经活动。当科学家把闪烁点从左侧移动到右侧，或从上方移到下方时，他们又在顶盖位置看到了水平和垂直方向的大脑信号。研究小组随后引入了活体草履虫。其被放置在幼鱼的头部附近，当它开始游动时，斑马鱼脑部的信号便会和猎物的运动步调趋于一致。

NO.7

蛋白复合体无损质谱鉴定

细胞中的每个蛋白质通常以蛋白复合体的形式实现特定生物学功能，所以识别和分析蛋白复合体的组分是研究蛋白功能所必需的。但由于蛋白质鉴定的困难，大多数蛋白复合体都是未知的。解析和鉴定蛋白复合体的最常用方法是利用抗体做免疫共沉淀分离复合体，再使用质谱方法鉴定复合体的组成成分并研究相关蛋白质的功能。

在绝大多数情况下，使用质谱技术对蛋白质进行分析时采用的都是“鸟枪法”分析策略，即首先将待检测的蛋白质分解成不同大小的肽段，然后再进行分析。虽然目前这种鸟枪测序法已经可以用于高通量的蛋白质组鉴定工作，但是在鉴定过程当中还是会丢失很多重要的生物学信息。我们知道蛋白质上经常会携带各种翻译后修饰信息，比如磷酸化等修饰信息，这些修饰物对蛋白质的功能都具有非常重要的影响作用，可是当蛋白质被分解成小片段之后我们就很难读取到这类修饰物的信息。不过新开发的一项质谱检测技术就可以对蛋白质或者蛋白复合体进行无损鉴定，今后这些重要的蛋白质功能信息就再也不会被遗漏了。在这种新技术下，蛋白质首先会经过比较轻柔的离子化处理，使其变为气态，此时蛋白质还会保留原有的三维立体结构，而且在合适的条件下，即便是更大的、以非离子键结合的、可溶性的膜蛋白复合体都可以保持原本的状态。

NO.8

机器自动分辨表型

识别细胞或者是模式生物的各种表型，通常都需要进行各种视觉上的辨别。比如：使用某种信号激活剂或者抑制剂之后，某种蛋白的细胞定位会发生哪些变化？某个特定基因突变或者被敲除之后，果蝇头部外形会发生哪些改变，或者小鼠的活动会出现哪些变化？对这些表型进行人工辨别，会是一项非常繁重的任务。尤其是在需要观测大量样本的情况下，更是让人难以承受。现在科学家们提出可以利用计算机，机器自动分辨生物表型。

要计算机进行表型识别，需要对机器进行训练，教会它们自己训练自己。要做到这一点，首先就要让机器学会如何从图像中挑选出可以进行表型识别的有用信息。这些图像信息有可能是静态的，也有可能是动态的；可以是细胞的图像，也可能是模式生物的图像或者是其它一些图像。研究者可以事先根据实验结果对各种表型进行基本的注释和分类，也可以让机器对其自动进行分类。

这种自动表型筛选仪，尤其适用于对成千上万个样品进行大规模筛查的工作。自动表型分选技术除了可以对表型进行定性的分选之外，还可以进行定量分选，此时需要对比较细微的表型差异进行鉴别，或者需要对大量的样本进行表型鉴别，然后进行统计学分析得出结论。此外，还可以对行为学表型进行鉴别，并自动进行录像，记录一定时间之内的表型变化等。

科学家们近期公布了一项这方面的最新研究成果——利用一种人工智能和前沿图像加工的自动化系统，快速检测了大量的个体秀丽隐杆线虫。这一系统无需人为干预就能够检测到线虫间的细微差异，而且能鉴别出用其他方式有可能无法检测到的遗传突变。

（作者单位：淮南联合大学）