液相色谱—串联质谱法测定猪尿中苯乙醇胺A

董文婷 朱曦 梁利妹 万珊

摘要：建立了一种超高效液相色谱—串联质谱法测定猪尿中苯乙醇胺A的方法。猪尿样品以莱克多巴胺—D3为内标，尿液经酶解提取后经 MCX固相萃取柱净化，超高效液相色谱—串联质谱法测定。苯乙醇胺A监测离子为m/z 344.7>149.5和m/z 344.7>326.7。结果表明在1～100 ng/mL范围内苯乙醇胺A呈良好的线性关系，高中低浓度相对回收率在98.8%～118.0%，变异系数小于10%，定量限为0.2 ng/mL。该方法用同位素内标法定量准确，适用于猪尿中苯乙醇胺A的残留测定。

关键词：猪尿；苯乙醇胺A；超高效液相色谱-串联质谱法；同位素内标法

中图分类号：S851.34 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2013）06-0009-02

苯乙醇胺A，又称作克伦巴胺。它是福莫特罗的同分异构体，是在合成莱克多巴胺时产生的副产物，具有和莱克多巴胺相同的作用和效果，属于β-激动剂的一种。

苯乙醇胺A作为β-激动剂，将其添加到饲料中，可以增加动物的瘦肉量、减少饲料的使用、节约成本，是一种新型违禁药物。

苯乙醇胺A，分子式为C19H24N2O4 ， 化学式为2-[ 4-（ 4-硝基苯基） 丁基-2-羟基氨基] -1-（4-为甲氧基苯基）乙醇， 化学结构式2-（ 4-（ nit- rophenyl ） butan-2-ylamino ）-1-（ 4-methox yphenyl） ethanol。其结构式见图1。

莱克多巴胺的结构式见图2。

通常实验室β-激动剂的确证方法有：LC-MS-MS法和GC-MS法[1]，农业采用有LC-MS法检测动物尿液中β-激动剂[2]，上海饲料中心近年来发布了饲料中苯乙醇胺A的液相色谱-质谱检测方法[3]。本文采用酶解方法，经前处理后干扰杂质少，再通过超高效液相色谱-串联质谱测定猪尿中苯乙醇胺A，该方法用同位素内标法定量结果准确可靠，适用于作苯乙醇胺A的残留确证分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

超高效液相色谱-串联质谱联用仪（ UPLC Quattro Premier） ，美国Waters 公司； AE260电子天平， Mettler-toledo公司；HimacCF16RX 高速冷冻机，HITACHI 公司；SIR4 漩涡振荡器，IKA 公司；Toledo 320酸度计，Mettler-toledo公司； PIERCE IL61105 样品浓缩器； MCX固相萃取柱， 60 mg/ 3 mL，美国Waters 公司；0.22 μm微孔滤头。

1.2 药品、试剂与材料

苯乙醇胺A，纯度96.0%，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；同位素内标莱克多巴胺（Ractopamine - d3）购自 Dr1Ehrenstorfer公司；甲醇、甲酸为色谱纯； 氢氧化钠、氨水、乙酸乙酯为分析纯；水为超纯水，美国MILLIPORE 超纯水仪自制；β-盐酸葡萄糖醛苷酶 /芳基硫酸酯酶（β-Glucuro-nidase/ aryl sulfatase）。

1.3 标准溶液储备液的制备（100 μg/mL）

准确称取苯乙醇胺A标准品约10 mg至100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即含苯乙醇胺A 100 μg/mL，于-20 ℃保存。

标准工作液A的制备（100 ng/mL）：精密量取0.10 mL储备液至100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得100 ng/mL的标准工作液，4 ℃保存备用。

标准工作液B的制备（10 ng/mL）：精密量取5.0 mL标准工作液A至50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得10 ng/mL的标准工作液，4 ℃保存备用。

同位素内标储备液的制备（100 μg/mL）：称取 10 mg的莱克多巴胺同位素内标置于100 mL棕色容量瓶中 ，用甲醇溶解并定容，于- 20 ℃条件下保存。

同位素内标工作液的制备（100 ng/mL）：精密量取0.10 mL储备液至100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得100 ng/mL的标准工作液，4 ℃ 保存备用。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱为Waters ACQUITYUPLC BEHC18柱 （50 mm×2.1 mm，粒径1.7 μm）；柱温：30 ℃；进样体积为5 μL；流动相A：0.1%甲酸甲醇溶液，流动相B：0.1%甲酸水溶液；流速0.2 mL/min；线性流动相梯度洗脱条件： 0 min，B：80%；0～1 min，B： 80%～20%；1～3 min，B： 20%～80%；线性变换。

1.4.2 质谱条件 离子源：电喷雾电离（ESI+） ； 扫描方式：正离子扫描； 检测方式：MRM（ 多反应监测）；毛细管电压： 3.2 kV，锥孔电压： 25 V；离子源温度： 110 ℃；雾化气温度： 350 ℃；雾化气流量： 650 L/h；锥孔气流速：50 L/h；光电倍增器：650 V。

1.4.3 样品前处理

（1）酶解。准确量取样品5mL于50 mL离心管中，加入 2 mol/L 乙酸铵溶液（ pH5.2） 0.5 mL， 再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶 /芳基硫酸酯酶40 μL， 涡旋混匀， 于37 ℃ 下避光水浴振荡16 h。

（2）提取。酶解后放置至室温， 添加100 ng/mL的同位素内标工作液100 μL于待测样中，涡旋混匀，10 000 r/min离心10 min，转移上清液于另一50 mL离心管内。用10 mol/L NaOH溶液调节pH至9.8±0.2，加入10 mL乙酸乙酯，再加入1.5 g 氯化钠固体饱和水相，涡旋混匀后振荡10 min，5 000 r/min 离心5 min，吸取上层有机溶剂于离心管中，再加入10mL乙酸乙酯，同前操作，合并提取液；氮气吹干（50 ℃）。用5 mL 2 mol/ L的乙酸铵溶液（pH5.2）溶解残余物，备用。

（3）净化。MCX 固相萃取柱依次用甲醇、水、0.2%甲酸各3 mL 活化，然后将备用液过柱；依次用水、0.2%甲酸、甲醇各3 mL 淋洗，减压抽干MCX小柱；再用5%氨化甲醇5 mL 洗脱，收集洗脱液，50 ℃下氮气吹干，用0.5 mL甲醇-0.1%甲酸/水（5+95，V/V）溶液溶解，经0.22 μm滤膜过滤后进行测定。

2 结果与分析

（1）苯乙醇胺A标准品和加标样品特征离子在上述仪器条件下，保留时间为1.85 min。结果表明，在相应的保留时间内，空白组织对被测物无任何干扰。

（2）标准曲线绘制。分别取适量苯乙醇胺A标准工作液，制得1、2、5、10、20、50、100 ng/mL 7 个浓度点的对照溶液（内标均为20 ng/mL）。以苯乙醇胺A和内标物的浓度比为横坐标，二者定量离子峰面积比值为纵坐标，得到苯乙醇胺A的标准曲线。苯乙醇胺A在1～100 ng/mL浓度范围内呈现良好线性关系，线性方程为y=33.834x+6.020 7，r=0.996 5。

（3）灵敏度的确定。将苯乙醇胺A标准工作液分别添加到3份空白猪尿中，制成浓度为0.1、0.2、0.5 ng/mL的添加样品，经1.4.3方法处理后，用超高效液相色谱-串联质谱检测，计算特征离子信噪比（S/N），当浓度为0.2 ng/mL（S/N大于10）为方法定量限，浓度为0.1 ng/mL（S/N大于3）为方法检测限。

（4）准确度和精密度的确定。采用标准添加法，在空白猪尿中添加0.5 ng/mL、2.0 ng/mL、10.0 ng/mL 3个不同浓度药物（内标浓度均为2.0 ng/mL）进行回收率试验，各浓度进行5 个样品平行试验，重复3次，求批内、批间相对标准偏差。由表1可知，该方法平均回收率为 98.8%～ 118.0%，批内RSD< 10%，批间RSD<10%。

3 讨论

3.1 质谱条件的优化

采用 100 ng/mL 的苯乙醇胺A标准溶液以流动注射的方式以多反应监测正离子模式优化质谱参数 ，在正离子模式下，化合物全扫描的分子离子[M+H] 最理想。选择目标母离子 ，对毛细管电压、锥孔电压、离子源温度、雾化气温度、离子能量等条件进行了优化。确定质谱参数后，进行子离子扫描并优化各子离子的碰撞能量。每个物质选择两个子离子，其中响应值较高的子离子作为定量离子，另一个作为辅助定性离子。