间充质干细胞治疗类风湿关节炎的研究进展

杨爱成 林辉遂 李杰峰 马春成 梁子安

【摘 要】 间充质干细胞是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于人体多种组织中，其具有多向分化、低免疫原性和免疫调节功能，在免疫调节、减轻炎症反应、损伤修复方面表现出广阔的应用前景，并在相关领域取得较大进展。该文从实验研究和临床研究两个方面对其在治疗类风湿关节炎方面的研究进展进行简要概述。

【关键词】 关节炎，类风湿；间充质干细胞；实验研究；临床研究；综述

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是以累及周围小关节为主的系统性、炎症性自身免疫疾病，以关节滑膜细胞增生、炎症细胞浸润及血管翳形成为主要病理特征[1]。目前对RA的治疗主要为减轻炎症反应以及对其造成的后遗症进行对症处理，尚不能满足临床对疗效的要求。因此，寻求更有效、更安全的治疗方案愈发重要。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是来源于发育早期中胚层的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，广泛存在于人体多种组织中，可在体外培养，并能在特定条件下分化为成骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等，在细胞替代治疗及组织工程修复方面有极大的应用价值。近年来，MSCs在风湿免疫疾病中的应用日益受到人们的重视。MSCs一方面具有分化为骨及软骨的能力，另一方面还具有抑制免疫、减轻炎症反应、抗纤维化及促进血管修复等作用，从而为RA的治疗带来新的希望。本文综述了MSCs在治疗RA方面的研究进展，从实验研究和临床研究两个方面进行了概括，并提出目前所面临的一些问题。

1 MSCs的来源、生物学特性及其与RA的关系

1.1 MSCs的来源 MSCs最初从成人的骨髓中分离获得，接着又成功从脂肪、结缔组织、胎盘、脐带血中分离获得；此外，还能从胚胎骨髓、肝脏、血液、肺、脾中获得。目前用于研究的主要来自骨髓、脐带血。

1.2 MSCs生物学特性 MSCs主要特点为，①多向分化潜能：MSCs具有基质细胞的特性，分泌多种细胞因子，在适当的诱导条件下可分化为成骨细胞、肌细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞和表皮细胞[2]；②免疫调节功能：免疫细胞分泌的促炎症因子干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、白介素-1α、白介素-1β激活间充质干细胞，发挥免疫抑制作用[3]；③连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于组织工程创伤修复和细胞替代治疗。

1.3 MSCs与RA 根据MSCs的生物学特性，近年来，人们对其在免疫性疾病的作用方面做了大量研究工作，期望通过MSCs的应用，减少此类疾病特别是RA的发病率，减轻发病后炎症反应，延缓疾病进一步发展，MSCs通过T细胞、B细胞、DC细胞、以及NK细胞等多个环节完成机体免疫调节作用，调节细胞因子的表达。而RA的病理基础主要是由T细胞介导涉及B细胞、细胞因子、细胞凋亡、蛋白酶等多种因素所致自身免疫性疾病，因此，应用MSCs治疗从而干预RA炎症病理基础成为可行方法。

2 实验研究

2.1 免疫调节作用 MSCs通过多种途径调节T细胞亚群的分化、增殖和活化，抑制B细胞的增殖和分化、树突状细胞（Dendritic Cells，DC）的成熟、NK细胞的活性等，来实现其广谱的免疫调节作用。

MSCs具有低免疫原性，表达MHC-I类分子，不表达MHC-II类分子，不表达共同刺激分子B7-1、B7-2、CD40、CD40配体及FAS配体，不受MHC分子的限制，在体内发挥免疫调节作用[4]。

张颢等[5]研究脐带源间充质干细胞（UC-MSCs）对异源T淋巴细胞的免疫调节作用，表明UC-MSCs能抑制PHA刺激的T淋巴细胞的增殖，改变T细胞亚群及T细胞分泌的细胞因子，对免疫反应具有负调节作用，可能为RA的治疗提供一条新途径。

毛飞[6]在探讨骨髓源间充质干细胞（BMSCs） 治疗Ⅱ型胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠的机制实验中表明，CIA阳性小鼠脾脏单个核细胞高表达 TLR8 及 TLR9，而经 MSCs治疗的 CIA 阳性小鼠其症状明显缓解，脾脏单个核细胞表达的 TLR8 及 TLR9 明显降低，接近正常小鼠的表达水平，这显示 BMSCs 可能通过调节 TLR8及 TLR9 的表达来实现其对RA的治疗作用。

刘燕鹰等[7]研究表明，UC-MSCs在体外可抑制RA患者成纤维样滑膜细胞（FLS）和T细胞的多种炎症反应，在体内可减轻CIA发生，提示UC-MSCs可能成为RA的治疗策略。刘燕鹰教授观察UC-MSCs对RA患者FLS和T细胞反应的影响，并利用小鼠模型评估人UC-MSCs对CIA的疗效。结果显示，在体外UC-MSCs可通过IL-10、吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）和转化生长因子β1（TGF-β1）抑制FLS增值。FLS的侵袭行为和分泌IL-6也被显著抑制。另外，UC-MSCs通过前列腺素E2等诱导T细胞介导的低反应性，并可促进CD4（+）Foxp3（+）调节性T细胞扩增。重要的是，全身输注人UC-MSCs可减轻小鼠模型CIA严重度，伴血清促炎性细胞因子和化学因子水平降低和抗炎性细胞因子增多。证实UC-MSCs对RA患者T细胞有免疫抑制作用，对参与RA发病的效应细胞FLS有免疫调节作用。且UC-MSCs对CIA模型有免疫治疗作用，可降低CIA小鼠临床评分，减轻关节破坏的病理学改变，并从血清学水平抑制炎性细胞因子、上调抗炎性细胞因子表达。对于MSC，既往研究多集中于骨髓、脂肪、脐血来源，这些MSC存在取材受限、分离培养方法不成熟及随供者年龄增大获得细胞数减少的缺点，限制了其临床应用，而UC-MSCs克服了上述缺点，有广阔临床应用前景。

2.2 减轻炎症反应 MSCs对炎症和损伤部位具有很强的趋向性[8-9]，此特性已经在动物实验中证实[10-11]。MSCs这种在体内微环境的条件作用下主动迁移到受损伤部位进行修复称为MSCs的“归巢”作用[12-15]。通过体外对MSCs介导的免疫调节作用的研究发现。

李慧等[16指出，CIA大鼠在治疗后第7天及第35天模型组大鼠血清IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α、VCAM-1和中性粒细胞表面CD11b的表达水平均高于正常组，UC-MSCs治疗后各因子水平显著低于模型组，治疗后第 35 天显著低于第7天，表明UC-MSCs能明显抑制 CIA 大鼠的炎症因子释放和抑制内皮细胞的异常活化，有利于缓解RA的免疫炎性关节症状。实验初探UC-MSCs治疗RA的结果，反映MSCs干预RA致病性炎症因子的释放及内皮细胞的活化作用，有利于修复RA免疫炎性、致畸性、关节功能异常。

Greish S等[17]运用UC-MSCs治疗弗氏完全佐剂诱导的RA大鼠模型结果表明，在关节炎症状改善方面，MSCs组（包括造血干细胞组和脐带间充质干细胞组）在治疗21 d后改善，34 d后完全消失。在减轻大鼠后肢的肿胀程度方面，MSCs组平均直径只有对照组和MTX组的一半，且UC-MSCs组比造血干细胞组小0.6 mm。血清生化方面，MSCs组的TNF-α、IFN-γ和IL-1对比对照组和MTX组明显降低，而IL-10的表达增加。苏木精-伊红（HE）染色表明，MSCs能明显减少关节腔的白细胞浸润和滑膜组织增生。Masson染色显示，几乎所有关节炎大鼠滑膜内的血管均有水肿，并且在血管壁能看到空泡形成，最后出血性坏死。此外，MSCs组还能减轻关节腔的广泛纤维化，结论为MSCs提高弗氏完全佐剂诱导的关节炎的治疗效果，其作用机制有可能通过调节细胞因子的表达和改善病理变化。

2.3 损伤修复 MSCs具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下可分化为成骨细胞、软骨细胞等，在组织重建中具有重要作用。Augello等[18]应用MSCs治疗胶原诱导性关节炎，结果表明了MSCs有减少关节骨与软骨破坏的作用，证实了MSCs在治疗关节炎骨的应用价值。

Wu CC等[19]研究发现，通过关节腔内注射UC-MSCs对CIA大鼠无任何益处，并且加速了TNF-α的产生，但是同时注射UC-MSCs和TNF抑制剂时，却明显减轻CIA大鼠的症状。病理上，UC-MSCs显著降低了CD90、HLA-G和IL-10的表达，其研究表明，TNF-α抑制了UC-MSCs的免疫抑制反应，TNF-α通过下调UC-MSCs的免疫原性，减轻UC-MSCs对软骨的破坏，使TNF-α抑制剂和UC-MSCs联合用药成为一种能改善RA症状的有效治疗手段。

2.4 其 他 Liu LN等[20]的最新研究指出，MSCs可能比当前可用的药物能更好地治疗RA。Liu通过对MSCs进行基因改造而能够表达依那西普，构建出作为载体发挥作用的人MSCs来运送这种TNF抑制剂，并注射到RA模型小鼠（6到7周大）体内，并对它们进行为期7 d的监控，作为比较，研究人员让另一组模型小鼠接受依那西普治疗。研究结果表明，MSCs能够产生与依那西普治疗一样的抗炎症效应，且速度更快。结果说明干细胞能够运送具有治疗价值的蛋白，并且证实干细胞能够潜在地在临床上用来治疗类风湿性骨关节炎和其他与TNF相关联的疾病。

3 临床研究

张效北等[21]采用MSCs治疗30例RA患者（细胞数为1×10的MSCs 30 mL静脉输注，同时沿脊柱两侧竖脊肌及骶髂关节区域点状注射按照 1∶4稀释后的MSCs），有效率占73.30%，临床症状明显缓解，疗效较好，可明显缓解和减轻RA患者的临床症状。

Zheng ZH等[22]MSCs未能引起Ⅱ型胶原蛋白反应性T细胞的阳性反应，而显著抑制Ⅱ型胶原蛋白反应性T细胞的增殖和以剂量依赖性方式活化抗原CD69和CD25的表达。此外，MSCs还抑制CD4+和CD8+T细胞分泌IFN-γ、TNF-α，并上调IL-10的水平，恢复IL-4的分泌。

王黎明等[23]采用静脉注射UC-MSCs（1×107人次）治疗17例RA患者，临床观察中发现，17例在饮食、睡眠、体力、疲劳等临床症状方面均有明显改善；全部患者均满足ACR20标准，15例患者28个关节的疾病活动度评分（DAS28） < 3.2；12例患者满足ACR70标准，DAS28评分 < 2.6，且治疗前后患者血常规、肝肾功、血清免疫球蛋白及补体C3、补体C4检测结果无显著变化，因此认为UC-MSCs具有免疫调节、阻止炎性介质释放、减轻组织损伤等重要作用，可减轻和缓解RA的临床症状，安全性很好，为临床治疗RA寻找到一条新途径。

王秦等[24]应用异基因UC-MSCs治疗3例RA患者发现，异基因MSCs移植后，3例RA患者随访9～11个月，均无移植相关并发症，移植后1个月疾病活动评分（DAS28）由5.13降低为2.16（n=3），1例血液系统受累患者血细胞（中性粒细胞、红细胞 、血小板）均上升；移植前后比较抗环瓜氨酸肽 （CCP）抗体滴度降低，1例患者移植前后比较 Thl7细胞明显升高，Treg细胞降低，所以MSC移植治疗难治性 RA有效、安全。此外，王秦等[25]还报道异基因UC-MSCs移植治疗RA患者1例，该患者对免疫抑制剂不能耐受，因此单独采用UC-MSCs治疗，治疗后4周，症状明显缓解，3个月后抗CCP抗体明显降低，取得较好疗效。Wang Q等[26]研究UC-MSCs对RA患者Th17细胞免疫调节的影响，结果表明，MSCs可明显降低Th7细胞及因子的表达，降低ROR-γt的表达，减少血清中IL-17的含量，且与剂量有较好的相关性；MSCs在体外与RA患者PBMC混合细胞培养可见，在高度活动组MSCs体外下调Th17水平，但在正常和轻度活动组并未见到类似调节，提示MSCs对Th17细胞的免疫调控可能受其他因子的调控。Oshita K[27]的研究表明，MSCs通过下调RANKL表达，上调OPG表达来抑制破骨细胞的分化，防止骨破坏进展，此外，MSCs可能在骨代谢和维持骨构成起重要作用，所以，MSCs是一种治疗RA很有发展前景的抗炎和骨修复手段。

4 存在问题

最初的研究中，MSCs主要来源于骨髓，但由于BMSCs存在高度病毒污染的可能，且随着年龄增长其细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势，故需要寻找一种能替代BMSCs并可弥补其缺陷的MSCs来源。由于脐血和脐带可通过非侵入性手段获得，相比骨髓更容易，并且病毒污染的风险低，还可冷冻保存后行自体移植，可作为MSCs 最理想的来源。然而，脐血中MSCs的培养成功率不高，研究认为只有6%，而脐带MSCs的培养成功率可达100% 。因此，近年来，脐带就成为M S Cs重要来源 。此外，尽管目前对MSCs的生理特性及作用机制有了较为深入的了解，但在RA治疗中仍存在很多问题需要解决，对疾病的治疗目前没有统一的干细胞移植方案，如移植前用药、移植细胞数、治疗的最佳时机等；治疗安全性及适应人群还需长期随访。

5 展 望

综上所述，MSCs无论在实验室研究还是临床研究方面均表现出优异的疗效，尤其是UC-MSCs更是其中的佼佼者。UC-MSCs能表达多种MSCs标志物及多种干细胞相关基因，具有多向分化潜力、低免疫原性等特点，这可能与其表达低水平的MHC-Ⅰ类抗原、不表达MHC-Ⅱ类抗原及FasL、也不表达相关的T细胞活化的共刺激分子有关[28]。其通过广泛下调炎症产物（如IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α等）或作用于免疫细胞的细胞毒介质，提高抗炎细胞因子IL-10的表达水平而显著减轻炎症。除了抑制免疫反应，在局部炎症中诱导分泌IL-10的调节性T细胞（Tregs）的产生。IL-10是Tregs的特征性细胞因子，在体内自抗原反应T细胞的控制中起重要作用，这些Tregs可抑制效应性T细胞对抗原的作用。UC-MSCs广泛降低细胞因子及趋化因子，直接激活巨噬细胞[29]。RA的发病机理与免疫机制的紊乱、细胞因子相关作用有关，UC-MSCs具有来源广、免疫原反应低，避开传统干细胞来源缺乏、异体排斥、道德伦理等诸多限制，具有很好的免疫调节和组织损伤修复作用，并且在临床上已经取得一定效果，值得进一步推广。

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