脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究

潘丽杰　陈妍　袁杰

[摘要]目的：分离培养人脐血间充质干细胞（ human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells， hUCB-MSC），体外观察其生长特性，并在特定条件下诱导分化，探讨其成脂成骨分化能力。方法：采用沉降法和密度梯度离心结合贴壁培养法自脐血中分离间充质干细胞，倒置显微镜下观察其形态及生长情况；流式细胞仪分析细胞周期并检测细胞表面标志物；用茜素红染色和油红O染色分别鉴定其成骨成脂分化能力。结果：纯化的hUCB-MSC贴壁生长，呈均一梭形，具有较强的增值能力，流式细胞仪分析P3代hUCB-MSC稳定表达间充质干细胞表面抗原标志 CD73，CD105 和 CD90 等，不表达造血标志 CD34 和 CD45；成骨诱导后3周后细胞茜素红染色阳性；成脂诱导3周后细胞油红O染色阳性。结论：本实验分离的hUCB-MSC具有较强的增殖能力，表达间充质干细胞的表面标记， 具有成骨成脂分化潜能。

[关键词]脐血；间充质干细胞；分化；鉴定

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）07-0735-04

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），作为一种成体干细胞用于再生医学修复各种间叶组织如骨、软骨、肌肉等，具有广阔的发展空间[1-2]，目前应用较为广泛为骨髓间充质干细胞，但由于骨髓取材属有创操作且干细胞随供体年龄增大有老化倾向等问题，在一定程度上限制其临床应用[3]。与骨髓间充质干细胞相比，脐血干细胞来源广泛，采集方便，不会对供者造成任何伤害，且有研究显示患者接受异体移植后，脐血来源的MSCs显示出更低的免疫原性反应[4-5]所以人脐血MSCs引起越来越多研究者的广泛兴趣。但是关于间充质干细胞的含量及能否成功体外培养存在很大争议。因此，本实验即探讨hUCB-MSCs的分离培养及其生物学特性，以期建立稳定的体外分离培养体系；同时对其体外诱导分化能力也进行深入研究，以期为下一步研究奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料：所有标本均取自哈尔滨医科大学附属第一临床医学院妇产科顺产及剖宫产的胎儿，孕妇体健，乙肝五项、梅毒等检测均为阴性，胎儿无先天性疾病，取血前征得产妇及家属同意并签署知情同意书。0.25%胰蛋白酶/EDTA、DMEM/F12（美国， Hyclone），胎牛血清FBS（美国，Gibco），人淋巴细胞分离液（1.077 g/ml，天津TBD公司），地塞米松、维生素C、吲哚美辛、β-甘油磷酸钠、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和胰岛素均购自美国Sigma公司。荧光标记小鼠抗人单克隆抗体：CD45-PE、CD34-APC、CD90-FITC、 CD105-FITC和CD73-PE均购自美国biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 hUCB-MSC的分离与培养[6]：经新生儿父母同意，采集新生儿脐血12份，每份50～80 ml，将所采集样本于4h内处理。将抗凝脐血用同体积的PBS稀释一倍，混匀，再与37℃预温的3%明胶等比混合，室温下静置至血浆与红细胞界面形成后，吸取血浆层，2000 r/min离心5 min，收集细胞；用5 ml DMEM/F12重悬所得细胞，按2：1的体积比加到人淋巴细胞分离液（1.077g/ml）表面，2000 r/min离心20 min，离心后吸取悬于分离液面的白膜层，获得单个核细胞。PBS洗两次，用DMEM/F12培养基（含体积分数为10%胎牛血清、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子bFGF、100U/mL青霉素和100 g/L的链霉素）悬浮上述细胞，计数，以1×107cells/ml浓度接种于25ml培养瓶，置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。4天后首次换液，以后每3天换液一次。倒置显微镜下观察细胞生长情况。细胞生长至 80%融合时，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，1：1传代。第一代后细胞生长达到 80%～90%时按 1：3传代。选用生长良好的P3代细胞做鉴定。

1.2.2 流式细胞仪检测细胞周期：取P3代细胞，0.25%胰酶/EDTA消化，制备单细胞悬液，并调整细胞数为1×106个，70%冰乙醇固定30 min，PBS洗2次，40mg/L RNAse中处理后离心，加入10g/L碘化丙啶0.5ml，染色30min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.3 hUCB-MSC表面标志的检测：取P3代细胞，在细胞达到80%融合时，0.25%胰酶/EDTA消化，制备单细胞悬液，并调整细胞数为1×106个，PBS洗两次，离心，弃上清，加入0.1mlPBS重悬，分别加入荧光标记的抗体及同型对照，室温避光孵育 20min。流式细胞仪检测CD90、CD105和CD73、CD45和CD34的表达情况。

1.2.4 hUCB-MSC分化能力检测：①成骨诱导：取P3代细胞以5×104个/ml 接种于六孔板，用含10% FBS的 DMEM/F12 培养 24h，待细胞贴壁伸展后，实验组换用矿化诱导液（含10nmol/Lβ-甘油磷酸钠，50μg/ml 维生素C，1×10-7mol/L地塞米松、10% FBS的DMEM/F12培养基），对照组仅用10%FBS的DMEM/F12培养基，每隔3天换液。镜下观察细胞复层生长并出现黄褐色结节后弃去培养基，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30min，1%茜素红染色10min，镜检、照相；②成脂诱导：将P3代细胞以 5×104个/ml的密度接种于六孔板，用含10%FBS的DMEM/F12 培养24h，待细胞贴壁伸展后，换用成脂诱导液（含0.25μmol/L 地塞米松，0.5mmol/L IBMX，100mmo1/L 吲哚美辛，10μg/L 胰岛素， 10% FBS 的DMEM/F12培养基），对照组不加诱导剂，每隔3天换液。镜下观察细胞内出现脂肪小滴后弃去成脂诱导液，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15min，油红O染色15min，显微镜下观察、照相。

2 结果

2.1 hUCB-MSC形态学观察：原代培养初期含有多种细胞成分，大部分细胞未贴壁，细胞为圆形或球形血细胞，第4天可见散在单个细胞贴壁，呈卵圆形，纺锤形和短梭形，逐渐伸出细胞突起，但无明显扩增；10天以后细胞体积增大，密度明显增加，少数 MSCs 呈多角形，大部分呈长梭形，细胞突起明显，且向周围伸展呈辐射状和网状生长；细胞培养约3～4周可达80%～90%融合即可传代。传代hUCB-MSC接种后 6～8h即可贴壁，细胞均匀散在分布，生长迅速，1周后可再次传代。随着换液和传代，异质性细胞逐渐被去除，贴壁细胞呈均一的成纤维样细胞，呈旋涡状生长。见图1。

2.4 hUCB-MSC分化能力鉴定：①成骨诱导：hUCB-MSCs 成骨诱导 1周时，细胞形态变化不明显；3周时可见钙化物形成，茜素红染色可见胞浆中有大量的红色钙化基质沉积，对照组无此变化，见图 3；②成脂诱导：hUCB-MSCs经成脂诱导1周，生长明显减慢， 细胞形态开始变得丰满，胞体变大，胞浆丰富，诱导2周左右在细胞核周围的胞浆内出现一些折光性强的圆形脂肪小滴。随时间的延长，脂肪滴逐渐增多并融合成大脂肪滴。3周后固定，1%油红O 染色可见细胞内有红染脂滴，大小不等，部分脂滴发生融合，主要分布在细胞核周围及其附近，对照组无此变化，见图3。

3 讨论

实验在查阅大量文献的基础上对培养条件进行了优化，首先选用含体积分数为10%FBS的DMEM/F12作为培养基，并加入bFGF，主要考虑以往试验中已经证明DMEM/F12能够提高培养效率[7]，而bFGF在间充质干细胞生长的信号传导中具有重要的作用[8]，促进间充质细胞贴壁。原代培养hUCB- MSC，主要有两种形态的贴壁细胞：一类呈椭圆形或圆形，体积大，这类细胞不能进一步增殖达到融合，最终趋于死亡。Erices等[7]认为此类细胞可能来源于脐血的破骨祖细胞，Wexler等[9]认为这群细胞表达了造血干细胞标志，为造血干细胞来源。本实验认为这类细胞来源于造血干细胞的可能性比较大，因为分离的单个核细胞大部分为造血干细胞，在培养中极易分化出造血系的细胞；另一类细胞呈均匀一致的长梭形，12份脐血标本有8份在第10天后出现大量MSCs，而圆形细胞很少，且MSCs增殖迅速，逐渐融合，传代后生长也很迅速，传3代后圆形细胞基本不见，剩下形态较为均一的漩涡样生长的纤维样细胞，即hUCB-MSC。流式分析显示约近80%处于细胞周期的G0/G1期。这些细胞自我更新能力很强，表现为细胞在传代后增殖迅速，可传至第18代，与Goodwin 等[10]报道一致。

目前，间充质干细胞的鉴定一般有两种方法，其一是通过表面标志物检测，脐带血间充质干细胞不表达或低表达造血干细胞的CDl4，CD34，CD45，不表达内皮细胞CD31，CDl44；表达CDl3，CD29，CD44，SH2（CDl05），SH3（CD73），CD90，SH4，HLA-I等[11]；另一种是从功能学上鉴定，即根据干细胞的生物学特性，在特定培养基中呈纤维细胞样贴壁生长，表现为幼稚细胞的特性，能够分化为至少两种不同的子代细胞。结合上述两种方法，本实验中流式细胞仪检测提示所分离培养的成纤维样细胞表达 CD73、CD105、CD90，不表达造血细胞相关抗原 CD34、CD45，证明这些细胞是区别于造血细胞且具有高度增殖能力的处于未分化状态的非定向干细胞。为进一步确定所纯化的MSCs是否具有多向分化潜能，分别进行成骨、成脂诱导分化，结果显示诱导3周后检测到钙化基质的沉淀与脂滴的形成，证明所培养MSCs具有多向分化潜能。

牙再生是利用组织工程原理形成组织、形态和功能与天然牙一样或相似的矿化组织。其中种子细胞是牙再生的基础与关键，目前牙源性干细胞为主要来源，但因其来源困难限制其应用，非牙源性干细胞如骨髓、脂肪、真皮来源的MSC逐渐被应用于牙再生研究。由于具有来源广泛，易获取且无伦理学限制，增殖分化能力更强等优点，目前有研究呼吁将脐血间充质干细胞作为牙再生种子细胞进行研究[12]。为此，本实验通过体外培养建立脐血间充质干细胞系，并探讨其生物学特性。实验结果表明体外分离的hUCB-MSC为长梭状成纤维样细胞，表达间充质干细胞标志，体外增值活力很强，经特定条件诱导，细胞可向脂肪细胞和成骨细胞方向分化，表明建立的细胞系为MSC并具有多项分化潜能。下一步我们将利用发育期牙胚所提供的微环境诱导人脐血间充质干细胞，探讨其牙向分化的可能性。hUCB-MSC可望作为种子细胞在牙齿再生组织工程学研究中有广阔的应用前景。

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[收稿日期]2013-02-02 [修回日期]2013-03-28

编辑/张惠娟