SSR分子标记技术在茄子杂交种子纯度鉴定中的应用

张敏 谈太明 徐长城 谈杰 黄树苹 王春丽

摘要：利用SSR分子标记技术进行种子纯度鉴定是一种准确快速、简单高效的方法。试验选用100对引物在鄂茄子2号亲本间进行PCR扩增，从中筛选出的3对引物SM17、SM29、SM51在双亲本间能够扩增出差异互补的条带。利用这3对引物对鄂茄子2号杂种一代群体进行纯度鉴定，鉴定结果为97.1%；与同批次种子的田间鉴定结果（96.1%，鉴定地点海南岛）接近，说明应用SSR分子标记技术实施茄子杂种一代种子的纯度鉴定是可行的。

关键词：茄子；SSR分子标记技术；种子纯度；鉴定

中图分类号：S641.1；Q503；S339.3+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）08-1959-04

种子纯度鉴定是种子质量保证的关键环节，直接影响到作物的产量和品质。传统的种子鉴定方法主要有种子形态鉴定法、幼苗鉴定法和田间小区种植鉴定法[1]，这些方法不仅需要较多的土地、劳力与财力，而且很容易受到环境因素的干扰，同时鉴定结果的准确性往往不高[2，3]。简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）是近年来发展起来的一种DNA分子遗传标记技术，该技术采用聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）完成检测，所需的DNA样品量少，对DNA质量要求也不高，加之SSR呈共显性遗传，可鉴别杂合子与纯合子；并且多态性丰富、重复性好、结果稳定可靠[4-7]，因而受到普遍欢迎，应用的农作物种类不断增加。SSR技术既有限制性内切酶片段长度多态性技术（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）的稳定性高和共显性强的优点[6，8，9]，又比随机扩增的多态性DNA标记技术（Randomly amplifiled polymorphic DNA，RAPD）成本低、技术简单[10]，所以在种子纯度鉴定中的应用非常广泛，已在水稻（Oryza sativa L.）[11-13]、小麦（Triticum aestivum L.）[14-20]、玉米（Zea mays L.）[21-25]、棉花（Gossypium spp.）[26-31]、大豆[Glycine max（L.）Merr.][32-35]、油菜（Brassica napus L.）[36，37]、花生（Arachis hypogaea L）[5，38，39]、向日葵（Helianthus annuus L.）[40]、苜蓿（Medicago sativa L.）[41，42]、西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.）Matsum. et Nakai.] [43]、甜瓜（Cucumis melo L.）[44]、黄瓜（C. sativus L.）[3，45]、大白菜[B. campestris L. ssp. pekinensis（Lour.）Olsson][46，47]、甘蓝（B. oleracea L. var. capitata L.）[48]、辣椒（Capsicum annuum L.）[49]、 番茄（Solanum lycopersicum L.）[50]、马铃薯（S. tuberosum L.）[51]、莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）[52]等农作物、蔬菜种子中都有报道。试验通过从美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库和相关文献报道中筛选合适的SSR引物，完成鄂茄子2号（Solanum melongena L. cv. E- Qiezi No.2）种子纯度的鉴定，以期为准确快速、简单高效的茄子杂交种纯度鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及处理 供试植物材料鄂茄子2号与其母本HLE-1、父本HLE-9均由武汉汉龙种苗有限责任公司提供，采用穴盘播种法育苗，在幼苗出现3～4片真叶时采集叶片，用液氮冷冻后放入冰箱（-70 ℃）内保存备用。

1.1.2 试剂 2×CTAB DNA提取缓冲液由2%CTAB、2%PVP、100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、25 mmol/L EDTA、2.0 mol/L NaCl组成；TE由10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA组成，用于DNA的溶解及保存，使用时添加RNase A 至终浓度为20 ng/mL；电泳缓冲液10×TBE由Tris 108 g、硼酸55 g、0.5 mol/L EDTA 40 mL加水至1 000 mL组成，工作浓度为0.5×TBE；Taq DNA聚合酶、dNTPs、分子量Marker为宝生物工程（大连）有限公司产品；其他各种化学试剂如氯仿、异戊醇、AgNO3、异丙醇、乙醇、NaAc等均为国产分析纯。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供，引物编号SM1-SM100。

1.1.3 仪器 主要有2720-PCR仪（美国ABI公司）、FR-980生物电泳图像分析系统（上海复日科技有限公司）、DYY-6C型全自动三恒多用电泳仪（北京市六一仪器厂）、DYCZ-28C垂直电泳槽（北京市六一仪器厂）、SPECORD200型紫外-可见光分光光度计（德国耶拿分析仪器股份公司）、GL21R高速冷冻离心机（上海知正离心机有限公司）、HH-8B数显恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂）、SW-CJ-1A 超净工作台（江苏省吴江市隆聚净化科技有限公司）、DHG-9420A-电热鼓风干燥箱（上海申贤恒温设备厂）等。

1.2 方法

1.2.1 茄子叶片DNA的提取 采用CTAB法[53]，随机选取鄂茄子2号F1幼苗150株，父本HLE-9、母本HLE-1各1株；每份材料取0.2 g叶片样，剪碎后放入2 mL EP管内（100 μL 的2×CTAB 加钢珠1颗）；在磨样器上将叶片打碎，加入700 μL的 2×CTAB混匀；65 ℃ 水浴1 h，每10 min上、下轻微颠倒一次；加入800 μL氯仿-异戊醇（24∶1，体积比，下同）混匀后于4 ℃、10 000 r/min离心10 min；取上清液于新的EP管中，再加入等体积的氯仿-异戊醇抽提一次；复取上清液于新的EP管中，加入等体积的异丙醇（约500 μL，-20 °C预冷）和1/10体积的3 mmol NaAc（约50 μL），混匀后于-20 ℃沉淀1 h；4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液，收集沉淀并风干；用700 μL 75%的乙醇洗涤沉淀2次，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清；加入200 μL TE（pH 8.0）溶解沉淀DNA，并加入1 μL 10 mg/mL RNaseA于37 ℃的电热鼓风干燥箱中放置1 h，以去除残留的RNA；用紫外-可见光分光光度计检测DNA浓度，将提取的DNA浓度调至100 ng/μL，置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 SSR引物的筛选 ①从NCBI数据库中挑选多态性较高的SSR引物100对[54]。②将引物用灭菌的去离子水溶解至 10 μmol。③PCR扩增，反应体系15 μL，包含1.50 μL 10×PCR Buffer、0.30 μL dNTPs（10 mmol）、0.25 μL Primer F（10 μmol）、0.25 μL Primer R（10 μmol）、0.20 μL Taq DNA聚合酶（相当于2.5 U/μL）、11.50 μL去离子水、1 μL DNA（100 ng/μL）。④PCR反应条件为94 ℃预变性10 min；94 ℃变性40 s，设置温度梯度52～60 ℃，退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。⑤PCR反应产物用琼脂糖凝胶预检测其扩增效果，并确定每对引物的最适退火温度。⑥调整好最适退火温度，分别以鄂茄子2号的父本、母本DNA为模板再次进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，找出能区分父本和母本的特异性引物。

1.2.3 F1代种子纯度检测 用筛选确定的特异引物进行鄂茄子2号F1群体检测（反应体系和条件同上）；将扩增后的PCR产物先用琼脂糖凝胶预检测，以确定PCR扩增是否成功；然后将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，AgNO3染色后拍照。

1.2.4 田间种植纯度鉴定 2011年秋季在海南岛试验基地采用营养钵播种，幼苗5～6片真叶时定植，行株距60 cm×50 cm，鄂茄子2号定植110株，其双亲各定植10株，常规栽培管理。在植株对茄期通过植株和果实特性的调查来比较各方差异，从而进行鄂茄子2号的纯度鉴定。

2 结果与分析

2.1 特异引物的筛选

用100对SSR引物对鄂茄子2号的双亲进行引物筛选，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测进行扩增，结果见图1。由图1可见，筛选到的引物SM17、SM29、SM51扩增带在父本和母本间出现互补条带，3对引物序列如下：

SM17——F链5′-ATCAATGACACCCAAAACC

CATTT-3′；R链5′-GTTTGAAAACCCAATACAAAT

CCGA-3′。SM29——F链5′-ATTGTGTCGATGAG

ATTTTGGTCA-3′；R链5′ GTTTAGCTACGTTGGTT

TGGTGCTGAA-3′。SM51——F链5′-AGTCCACCA

TGAGTGAGTGAGTGA-3′；R链5′-GTTTACGTGTT

GGGCCTCCAAAATATC-3′。

这个结果说明3对引物可以区分父本和母本，因而可用于鄂茄子2号种子纯度的检测。

2.2 F1种子纯度的检测

提取鄂茄子2号的F1样品DNA，经检测最终获得140份可用样品。用上述3对引物分别进行样品PCR扩增检测，其中引物SM17和SM29纯度鉴定结果一致，因此选用引物SM17进行鄂茄子2号的纯度检测，结果见图2。试验在140份样品中出现了4个同父本的单条带，说明这4株为杂株，剩下的为纯合F1代，因此被鉴定的鄂茄子2号种子纯度为97.1%。

2.3 田间纯度鉴定

在海南岛试验基地种植的鄂茄子2号最后存活植株103株，当茄果达到正常商品果时统一进行性状调查，通过比较株型、叶型、果型、果色、萼片色等表型性状对群体进行纯度鉴定，经检测确定杂株4株，因此计算其纯度检测结果为96.1%，这与SSR技术检测的结果接近，说明SSR技术能够用于茄子F1代种子纯度的快速检测。

3 讨论

试验利用SSR技术实施鄂茄子2号种子纯度的鉴定，结果与田间鉴定结果保持了较好的一致性，说明利用SSR技术替代田间种植观察完成茄子种子纯度的快速检测是可行的，有望克服田间调查周期长、受环境因素干扰较大等问题。

试验在NCBI数据库中下载了100对SSR引物，但从中仅筛选出了3对有用的引物，其利用率相当低；而在同种作物、不同品种间由于亲缘关系较近，SSR表现出来的多态性都较差，因此在种子纯度鉴定中SSR引物筛选的难度还是比较大的。同时，此技术前期开发新的SSR引物费时耗力，并且成本高，使得SSR技术在实际运用中受到了一定的限制。不过随着NCBI数据库的不断扩大和研究者的不断挖掘，更多的SSR位点将被标记出来，进而开发成本也会降低。所以有理由相信SSR技术在种子纯度鉴定方面的应用前景广阔。

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