蜡样芽孢杆菌CGMCC4348菌株防治番茄灰霉病的效果及机理研究

唐容容 杨文革 胡永红 江心敏 刘邮洲 章泳

摘要：试验研究蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）CGMCC4348菌株对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）的生物防治效果，并初步探讨其抑菌机理，以寻找防治番茄灰霉病的新方法。试验从定量生物测定、室内离体抑菌试验和盆栽试验3个方面考察其抑菌作用效果，并以硫酸铵分级沉淀法提取拮抗蛋白进行检测。结果表明，室内抑菌试验的EC50为6.19 mg/L；盆栽试验中处理3对番茄灰霉病的平均防效达75.80%，与50 mg/L嘧霉胺处理的防效相当。试验证明蜡样芽孢杆菌CGMCC4348对番茄灰霉病菌有较好防治效果。

关键词：蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）；番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）；生物防治；CGMCC4348

中图分类号：S436.3；S476.19 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）08-1817-04

灰霉病可侵染200多种植物的花、果实及其他绿色组织[1，2]，导致组织腐烂，丧失利用价值。近年来中国蔬菜灰霉病发生面积逐年增加，成为蔬菜生产的一大障碍[3]。其中茄科蔬菜以番茄受害最重，一般发病田块番茄灰霉病造成的产量损失为20%～40%，重病田块达60%以上[4]。

长期以来生产上主要依靠化学农药防治灰霉病，病原菌对常用化学药剂极易产生抗药性，且长期依赖和大量使用化学农药会带来环境污染和食品安全等问题[5-7]。多种真菌、细菌对灰霉病菌均有一定的抑制作用[8]，如木霉、粘帚霉、酵母菌、假单胞杆菌等，近年利用生防菌成为植物灰霉病防治的新策略。作者在番茄病害生物防治研究中筛选到1株可有效抑制番茄灰霉病菌（灰葡萄孢菌，Botrytis cinerea）的生防菌株，经鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），命名为CGMCC4348[9，10]。本研究以室内抑菌试验与盆栽防效试验结合的方式来探讨该生防菌对灰霉病的防治效果，并提取有效拮抗蛋白进一步探索其抑菌机理，以期为设施茄果类蔬菜病害绿色防控技术提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株

生防菌：蜡样芽孢杆菌CGMCC4348，南京工业大学生物与制药工程学院实验室分离和保存，发酵培养基为YPG培养液[11]，菌种活化与保存采用营养琼脂培养基[12]。

番茄灰霉病病原菌：灰葡萄孢菌，江苏省农业科学院植物保护研究所生物防治实验室分离和保存，采用PDA培养基[13]培养。

1.2 定量生物测定

将番茄灰霉病菌在PDA平板上活化，25 ℃培养待用；活化后的蜡样芽孢杆菌CGMCC4348于YPG培养液中28 ℃、140 r/min振荡培养36 h。

定量生物测定采用平板对峙法，将蜡样芽孢杆菌菌液稀释成不同的浓度梯度，每浓度处理重复5次，以无菌液体培养基作为对照，计算菌丝生长抑制率[14]。数据处理采用DPS软件[15]，建立浓度对数—抑制百分率机率值毒力回归方程式，计算抑制中浓度（EC50）。

1.3 离体抑菌试验

取新鲜番茄苗第三、第四片真叶，用无菌水洗净，置于装有湿滤纸的培养皿中，打孔器打取灰霉菌菌饼，无菌条件下接于叶片之上。对照，只接灰霉病菌；处理1，接入灰霉病菌36 h后以喷雾方式接入1 mL生防菌发酵液；处理2，喷雾接入1 mL生防菌发酵液后接入生防菌，24 h后接入灰霉病菌。每处理重复5次。培养皿置于人工气候箱中，温度28 ℃，光照12 h/d，相对湿度60%。70 h后观察抑菌效果。

1.4 盆栽防效试验

将无菌条件下萌发的番茄种子（品种为日本美玉）播于土壤（自然土∶营养土∶蛭石为5∶4∶1）中，温室育苗，当番茄苗长出4片真叶时盆钵单株移栽。以无菌水洗下番茄灰霉病菌分生孢子，制成4×106个孢子/mL浓度的灰霉孢子悬浮液，以喷雾的方式均匀接种于番茄叶部10 mL，灌根10 mL。生防菌稀释至1×106 CFU/mL，以喷雾方式接种10 mL于叶片上。各处理如下：对照，只接种灰霉孢子液，后续清水处理；处理1，同时进行灰霉孢子液和生防菌液处理；处理2，灰霉孢子液处理 2 d后，接种生防菌液；处理3，生防菌液连续处理2 d后，接种灰霉孢子液；处理4，灰霉孢子液处理后喷雾50 mg/L嘧霉胺10 mL。每处理60盆，温室培养。温室温度20～25 ℃、相对湿度80%～90%。采用文献[16]方法统计病情指数及防效。病情分级的根据是叶片病斑面积占整个叶面积的百分比，0级，无病斑；1级，≤5%；3级，5%～10%；5级，10%～20%；7级，20%～50%；9级，≥50%。

1.5 抑菌作用机理试验

1.5.1 拮抗蛋白的提取 蜡样芽孢杆菌发酵液4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取离心上清液在室温下加入硫酸铵，使其饱和度达室温下的20%，充分搅拌60 min后，于4 ℃、1 2000 r/min离心20 min，收集第一级沉淀物和第一级上清液。将第一级上清液以15%饱和度为梯度，继续加入硫酸铵充分搅拌，重复上述步骤，收集不同组分的上清液与沉淀。第一、第二、第三、第四级沉淀组分分别记为A、B、C、D。沉淀组分用PBS溶解并透析[17]，得到抗菌蛋白提取液。

1.5.2 发酵液不同组分抑菌效果研究 各组分进行平板对峙试验。处理1，蜡样芽孢杆菌发酵液；处理2，发酵液4 ℃、8 000 r/min离心10 min得到的上清液；处理3，相同离心方法得到的不同稀释梯度沉淀；处理4，硫酸铵分级沉淀得到的蛋白组分A、B、C、D；处理5，去除蛋白组分后的上清液组分，以无菌水处理作为对照。每处理重复5次。

2 结果与分析

2.1 定量生物测定结果

平板对峙试验结果表明，不同浓度梯度的蜡样芽孢杆菌CGMCC4348对番茄灰霉病菌菌丝的生长表现出不同程度的抑制作用，生防菌菌液直接处理的抑菌圈直径为2.9 cm，抑制率达72.90%，效果最为明显。利用DPS数据处理系统得到毒力回归方程及抑制中浓度（表1），其EC50为6.19 mg/L，95%置信区间为0.563 5～25.678 3，模型相关性良好。从相对毒力指数可以看出该生防菌毒力高于灰霉病常用防治药剂嘧霉胺。

2.2 离体抑菌试验结果

蜡样芽孢杆菌CGMCC4348室内离体抑菌试验结果见图1。从图1可见，蜡样芽孢杆菌CGMCC4348对番茄灰霉病有极好的防治效果。对照组番茄叶片发病严重，病原菌菌丝茁壮，病部表面产生浓密灰色霉层，凡菌丝触及的地方叶片腐烂。与对照组相比，处理1叶片上出现较小水渍状病斑，无菌丝生长，生防菌对灰霉病的发生和蔓延起到了有效的控制作用。处理2中灰霉菌菌丝明显萎缩，叶片均未发病，表明该生防菌不仅对菌丝生长有极强的抑制作用，还可提高叶片对灰霉病的抗性，保证叶片不发病。

2.3 盆栽试验中蜡样芽孢杆菌防治番茄灰霉病效果

盆栽试验结果（表2）显示：处理3即生防菌液处理2 d后接入灰霉孢子液防治效果最好，防效为75.80%，与50 mg/L嘧霉胺处理组的防效相当。嘧霉胺是常用的灰霉病防治农药，但在应用于防治番茄灰霉病过程中病原菌会对其逐渐产生抗性，实用性降低，从试验看，效果不如蜡样芽孢杆菌。处理3的防治效果优于处理2，是因为提前对番茄苗接入蜡样芽孢杆菌菌液，提高了植物的抗性，在等量病原菌处理情况下其发病率更低。Benhamou等[18]、夏立秋[19]的研究也发现蜡样芽孢杆菌可通过诱导植物产生抗性来发挥生防作用。蜡样芽孢杆菌CGMCC4348提高番茄植株对灰霉病抗性的机理有待后续研究。

2.4 蜡样芽孢杆菌对番茄灰霉病病原菌的抑制作用机理

在平板对峙试验中发现，生防菌菌落周围有明显的抑菌圈（图2），说明蜡样芽孢杆菌CGMCC4348的拮抗作用与胞外分泌的拮抗物质有关。通过对番茄灰霉病病原菌的抑制作用机理试验结果（表3）可看出，硫酸铵沉淀法提取出的二级蛋白组分B拮抗作用最强，抑制率为68.81%，接近于发酵液对病原菌的抑制率。说明发酵液中存在对番茄灰霉病具有很强抑制作用的拮抗蛋白。除蛋白后的发酵液上清液组分对灰霉菌无抑制效果，说明生防菌产生的拮抗物质主要为胞外蛋白。发酵液离心后的沉淀主要是菌体，其抑菌效果不明显，抑制率远低于上清液的55.25%，推测是离心造成菌体裂解，使其活性下降，但该试验结果不能完全说明菌体对病原菌无抑制作用。在大田环境中，菌体能与病原菌在植物叶片或根、茎上进行营养等生存环境竞争，以定殖方式产生稳定的拮抗作用。大田实际效果有待后续工作中进行深入研究。

3 小结与讨论

灰霉病是一种严重危害番茄品质和产量的真菌病害，利用具有生防作用的芽孢杆菌属菌株来防治此类真菌性病害是近年科研工作者研究的热点之一，其中应用较多的是枯草芽孢杆菌。研究和开发其他芽孢杆菌，增加生防菌在防治过程中的生态多样性，对生物防治更为有利。试验首次采用具有自主知识产权的蜡样芽孢杆菌CGMCC4348进行定量生物测定、离体抑菌试验和盆栽试验，试验结果证实此菌株对番茄灰霉病病原菌有良好的抑制作用。室内抑菌试验同时表明该生防菌能分泌抗真菌的拮抗物质，并对病原菌起主要抑制作用。试验初步提取出具有拮抗作用的蛋白组分，在后续研究中对蛋白组分进行进一步纯化，并对其结构与生理生化特性进行深入研究，将对探索生防菌控制植物真菌病害效果的提高和稳定具有重要的理论与实践价值。室内抑菌试验与盆栽试验中生防菌防效与嘧霉胺相当，甚至优于嘧霉胺处理组，在此基础之上，后续将进行田间防效试验，并对此菌株进行标记以研究其定殖机理，为研制新型高效的生物农药提供依据。

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